碧云天生物技术-乙醛检测试剂盒(WST-8法)(S0565S)

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乙醛检测试剂盒(WST-8法)

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S0565S	乙醛检测试剂盒(WST-8法)	100次	998.00元

碧云天研发的乙醛检测试剂盒(WST-8法) (Acetaldehyde Assay Kit with WST-8)，也称醛检测试剂盒或Aldehyde Assay Kit，是一种基于WST-8的显色反应，利用吸光度检测，简单、快速、高灵敏地对血清、血浆等生物体液、组织、细胞以及组织或细胞培养上清以及食品、饮料等样品中醛类特别是乙醛含量进行检测的试剂盒。

醛(Aldehyde)是醛基(-CHO)和烃基(或氢原子)连接而成的化合物，低级醛为液体，高级醛为固体，只有甲醛是气体。常见的醛有甲醛(Formaldehyde)、乙醛(Acetaldehyde)、丙醛(Propionaldehyde)、苯甲醛(Benzaldehyde)等。乙醛是最重要的醛类之一，分子式为CH3CHO，在自然界中广泛存在，并在工业上大规模生产。乙醛天然存在于咖啡、面包和成熟水果中[1]。作为乙醇和糖类代谢的中间产物，乙醛在人体血液中微量存在。乙醛也少量存在于所有酒精饮料中，如啤酒、葡萄酒和烈酒，以及植物汁和精油、烘焙咖啡和烟草烟雾中[2]。据报道，乙醛蒸气的刺激作用会引起咳嗽和鼻子、喉咙和眼睛的灼热感，长时间与皮肤接触会导致红斑和烧伤，反复接触可导致皮炎[3]。有研究表明，乙醛在实验动物中有一定的致癌性。通过吸入暴露途径对鼠类进行乙醛的致癌性检测，吸入后会引起呼吸道肿瘤，特别是大鼠鼻粘膜腺癌和鳞状细胞癌及仓鼠喉癌。国际癌症研究机构(International Agency for Research on Cancer，简称IARC，为世界卫生组织下属机构)将乙醛列为2B类致癌物[4]。

本试剂盒的检测原理请参考图1。乙醛(Acetaldehyde)或其它醛在醛脱氢酶(Aldehyde dehydrogenase, ALDH,常被称为乙醛脱氢酶)的作用下氧化生成乙酸(Acetic acid)等，在这一反应过程中NAD+被还原为NADH；生成的NADH在电子耦合试剂(Electron mediator)的作用下将WST-8还原生成橙黄色的Formazan，在450nm左右有最大吸收峰。反应体系中Formazan的生成量与样品中乙醛或其它醛的含量成正比。

图1.碧云天乙醛检测试剂盒(WST-8法) (S0565)检测原理图。

本试剂盒检测灵敏度高，线性范围宽，样品用量少。醛脱氢酶通常能催化包括乙醛、甲醛、丙醛、戊二醛等在内的多种醛的脱氢反应，且对不同醛类的反应活性存在一定的差异，所以本试剂盒对不同种类的醛的检测灵敏度和线性范围可能存在一定的差异。以乙醛为例，本试剂盒在样品体积为20µl时，可以检测浓度低至0.001mM的乙醛，在0.001-2mM浓度范围内有良好的线性关系。本试剂盒提供了乙醛标准溶液，可以通过绘制标准曲线(图2)，从而计算出样品中的乙醛含量。

图2.碧云天乙醛检测试剂盒(WST-8法) (S0565)检测乙醛标准品的标准曲线。20µl用Acetaldehyde Assay Buffer稀释的不同浓度的乙醛标准品，加入80µl Acetaldehyde反应工作液并混匀后，25ºC避光孵育30分钟，在450nm处测定吸光度。乙醛标准品在0.001-2mM浓度范围内有良好的线性关系。实际检测数据会因实验条件、检测仪器等的不同而存在差异，图中数据仅供参考。

本试剂盒提供的检测裂解液有一定的通用性。使用本试剂盒中的BeyoLysis™ Buffer H for Metabolic Assay裂解获得的细胞或组织样品，也可以用于碧云天生产的其它代谢类试剂盒中同样使用BeyoLysis™ Buffer H for Metabolic Assay进行裂解的样品检测，通用性强。

本试剂盒使用灵活，检测速度快，适用范围广。本试剂盒可用于小鼠、大鼠、人等的血清、血浆等生物体液，细胞培养上清、组织或细胞及食品、饮料样品等的检测，全程约0.5-1小时即可完成。本试剂盒不仅适合少量样品的检测，也非常适合高通量筛选(High-throughput screening)的自动化操作系统。

按照使用说明操作，用于96孔板检测时，本试剂盒小包装可以进行100次检测。

包装清单：

产品编号	产品名称	包装
S0565S-1	BeyoLysis™ Buffer H for Metabolic Assay	15ml
S0565S-2	Acetaldehyde Assay Buffer	15ml
S0565S-3	Substrate	500µl
S0565S-4	WST-8	200µl
S0565S-5	Enzyme Solution	200µl
S0565S-6	Acetaldehyde Standard (100mM)	100µl
—	说明书	1份

保存条件：

-20ºC保存，一年有效。其中WST-8和Acetaldehyde Standard (100mM)须避光保存。

注意事项：

由于醛脱氢酶的底物特异性问题，本试剂盒不仅可以检测乙醛，也可以检测甲醛、丙醛、戊二醛等醛类物质。

Acetaldehyde Standard (100mM)具有一定的挥发性，使用后须及时旋紧管盖。

Acetaldehyde Assay Buffer和Substrate需要完全解冻并平衡至室温后再使用，否则会影响检测结果。其它各种溶液使用时应在冰上进行。

经测试，本试剂盒相对稳定，检测所得的乙醛标准曲线的线性范围通常和说明书中的描述一致，但是实际效果可能会因为实验条件、检测仪器等的不同而存在差异，例如最高浓度点的数据偏低或不在线性范围内等，通常可以舍去异常点的数据，取在线性范围内的数据来拟合标准曲线。血清、血浆等样品如果在4ºC保存，保存的时间不得超过2周，否则会影响检测结果的准确性。通常血清样品宜在-20ºC保存，-80ºC保存更佳。

本试剂盒检测时涉及氧化还原反应，因此抗氧化剂(如多酚)或还原剂都会干扰本试剂盒的检测。

Acetaldehyde Standard (100mM)对人体有害，操作时请小心，并注意有效防护以避免直接接触人体或吸入体内。

本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。

为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用说明：
1.样品的准备。
a.血液样品的准备：对于血清样品，将全血在常温如25ºC下放置30分钟-2小时，不要剧烈摇晃以免溶血，待全血自然凝固并析出血清后，4ºC约1000-2000×g离心10分钟，取黄色上清即得血清，注意不要吸取白色或淡黄色沉淀；对于血浆样品，将全血用肝素或者EDTA进行抗凝，4ºC约1000-2000×g离心10分钟，取黄色或淡黄色上清即得血浆，注意不要吸取白色沉淀。血清和血浆都需置于冰上，如果不能立即检测，也可以分装并短期保存于-20ºC或-80ºC。对于冻存的样品，在检测前解冻后冰浴存放备用，使用前必须混匀。
b.细胞或组织样品的准备：对于培养的贴壁细胞，PBS (C0221A)洗涤一次并吸净残留液体。对于培养的悬浮细胞，先适当离心(如100-500×g，5分钟)收集细胞到离心管内，弃上清并吸净残留液体。按照每100万细胞加入100-200μl BeyoLysis™ Buffer H for Metabolic Assay的比例加入裂解液，使用TissueMaster™高通量组织研磨仪(1.5/2ml×48) (E6618)、TissueMaster™手持式组织研磨仪(E6600/E6607)或玻璃匀浆器在约4ºC或冰浴等低温条件下进行匀浆。对于贴壁细胞，使用细胞刮或细胞铲，刮铲下细胞后再进行匀浆。4ºC约12,000×g离心3-5分钟，取上清用于后续检测。对于组织样品，按照每10mg组织加入100μl BeyoLysis™ Buffer H for Metabolic Assay的比例，使用TissueMaster™高通量组织研磨仪(1.5/2ml×48) (E6618)、TissueMaster™手持式组织研磨仪(E6600/E6607)或玻璃匀浆器在约4ºC或冰浴等低温条件下进行匀浆。4ºC约12,000×g离心3-5分钟，取上清用于后续检测。以上所有操作均需在4ºC或冰上操作。制备好的细胞或组织样品如果不能立即检测，可以-20ºC或-80ºC冻存。
c.细胞培养上清样品的准备：对于贴壁细胞，直接取培养液；对于悬浮细胞，离心取培养液。
d.生物液体样品：可在离心去除颗粒物质后直接测定。
e.食品、饮料样品：对于固体样品，在BeyoLysis™ Buffer H for Metabolic Assay中均质或粉碎固体样品，必要时进行过滤；对于透明和轻微颜色、pH值接似中性的饮料等液体样品，可以直接测定；对于有色样品，建议进行样品背景对照的设置，即加入不含Enzyme Solution的Acetaldehyde Working Solution；对于酸性样品(如葡萄酒或果汁)，则应将溶液的pH值调整到约8.0再进行测定；对于含有大量二氧化碳的样品(如啤酒)，先进行脱气处理，并将溶液的pH值调整到约8.0再进行测定。
注：对于细胞、组织等需要裂解的样品的准备，也可以用其它合适的裂解液进行裂解，但不同裂解液制备的样品的测定效果可能存在一定的差异。如果样品中的乙醛浓度比较高，需要适当稀释后检测。
2.试剂盒的准备。
a.融解Acetaldehyde Assay Buffer，平衡至室温后混匀备用。其它试剂存放于冰浴备用，使用完毕后宜立即按照试剂盒要求的条件保存。
b.Acetaldehyde反应工作液(Working Solution)的配制：按照每个反应80µl的体积配制适量的Acetaldehyde反应工作液。均匀混合71µl Acetaldehyde Assay Buffer、5µl Substrate、2µl WST-8、2µl Enzyme Solution，即可配制成80µl Acetaldehyde反应工作液。根据待检测样品(包括标准品)的数量，配制适量的Acetaldehyde反应工作液。具体配制方法参考下表。Acetaldehyde反应工作液须现配现用。

Samples	1	10	20	50
Acetaldehyde Assay Buffer (µl)	71	710	1420	3550
Substrate (µl)	5	50	100	250
WST-8 (µl)	2	20	40	100
Enzyme Solution (µl)	2	20	40	100
Working Solution (µl)	80	800	1600	4000

注1：由于酶溶液的用量较少且易沉降，必须注意在使用前先轻轻离心一下，然后适当混匀后再使用。
注2：NADH的存在会对乙醛的检测产生干扰。如果样品含有NADH，需同时设置样品背景对照孔，加入不含Enzyme Solution 的Acetaldehyde Working Solution，即配制Acetaldehyde Working Solution时2µl Enzyme Solution用Acetaldehyde Assay Buffer替代。计算时样品孔的读数值需要减去样品背景对照孔的读数。
注3：Acetaldehyde反应工作液宜现用现配。配制好的Acetaldehyde反应工作液在储存过程中可能会引起背景值升高，进而影响检测效果。Acetaldehyde反应工作液的配制也可以在步骤3b加样完成后再进行，即配即用。
3.样品测定。
a.乙醛标准曲线设置。取2μl Acetaldehyde Standard (100mM)，加入98μl Acetaldehyde Assay Buffer，混匀，配制成浓度为2mM的乙醛标准溶液。分别取2mM的乙醛标准溶液0、0.2、0.5、1、2、5、10、20μl加入96孔板的标准品孔中，并相应地用Acetaldehyde Assay Buffer补足至20μl，此时，标准曲线的浓度分别为0、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1、2mM。
b.取1-20μl样品或稀释后的样品至96孔板样品孔中，并相应地加入Acetaldehyde Assay Buffer至样品孔中，补足至20µl。同时设置仅含Acetaldehyde Assay Buffer的孔为空白对照。
注1：为确保样品数值在标准曲线范围内，建议进行预实验将样品设置多个稀释倍数，以确定样品中乙醛的大致浓度，如果数值不在标准曲线范围内，请调整样品的稀释倍数或者样品的量。样品总稀释倍数记为n (例如本步骤中对样品进行了5倍稀释，加入的“稀释后的样品”为10µl，则n=5×20/10=10)。
注2：对于血清、组织裂解液上清等复杂样品，建议将适当样品设置多个稀释倍数进行预实验，在适当的稀释倍数时，样品的信号值和样品中的蛋白量通常会呈现出良好的线性关系。再根据预实验的结果，选取适宜的稀释倍数用于后续的测定，否则即使信号值在标准曲线的线性范围内，也可能无法得到理想的检测结果。
c.各孔加入Acetaldehyde反应工作液80µl，混匀，25ºC避光反应30分钟。
d.在450nm处测定吸光度。
e.建立标准曲线，并计算样品中乙醛的浓度A (mM)，如果样品的背景对照信号比较高，样品的信号值应减去样品背景对照的信号值。乙醛标准曲线可以参考图2，在0.001-2mM浓度范围内有良好的线性关系。乙醛浓度的计算公式如下：
C (mM)=A×n
注：A (mM)为步骤3e根据标准曲线确定的乙醛浓度；
n为步骤3b样品总稀释倍数。
参考文献：
1.Uebelacker M, Lachenmeier DW. J Autom Methods Manag Chem. 2011. 2011:907317.
2.Hagemeyer HJ. Kirk-Othmer Encyclopedia of Chemical Technology. 1991. 1991:94–109.
3.Acetaldehyde. IARC Monogr Eval Carcinog Risks Hum. 1999. 71 Pt 2(PT 2):319-35.
4.https://monographs.iarc.who.int/agents-classified-by-the-iarc/
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