使用说明：
1.样品的准备：
a.血液样品的准备：对于血清样品，将全血在常温如25ºC下放置30分钟至2小时，不要剧烈摇晃以免溶血，待全血自然凝固并析出血清后，4ºC约1000-2000×g离心10分钟，取黄色上清即得血清，注意不要吸取白色或淡黄色沉淀；对于血浆样品，将全血用肝素或者EDTA进行抗凝，4ºC约1000-2000×g离心10分钟，取黄色或淡黄色上清即得血浆，注意不要吸取白色沉淀。血清和血浆都需置于冰上，如果不能立即检测，也可以分装并短期保存于-20ºC或-80ºC。对于冻存的样品，在检测前解冻后冰浴存放备用，使用前必须混匀。
b.细胞或组织样品的准备：对于培养的贴壁细胞，PBS (C0221A)洗涤一次并吸净残留液体。对于培养的悬浮细胞，先适当离心(如100-500×g, 5分钟)收集细胞到离心管内，弃上清并吸净残留液体。按照每100万细胞加入100-200μl BeyoLysis™ Buffer A for Metabolic Assay的比例加入裂解液，适当吹打，冰浴5-10分钟以充分裂解细胞。4ºC约12,000×g离心3-5分钟，取上清用于后续检测。对于组织样品，按照每10mg组织加入100μl BeyoLysis™ Buffer A for Metabolic Assay的比例，使用TissueMaster™高通量组织研磨仪(1.5/2ml×48) (E6618)、TissueMaster™手持式组织研磨仪(E6600)或玻璃匀浆器在约4ºC或冰浴等低温条件下进行匀浆。4ºC约12,000×g离心3-5分钟，取上清用于后续检测。以上所有操作均需在4ºC或冰上操作。制备好的细胞或组织样品如果不能立即检测，可以-20ºC或-80ºC冻存。
c.细胞培养上清样品的准备：对于贴壁细胞，直接取培养液；对于悬浮细胞，离心取培养液。
2.试剂盒的准备：
a.融解BeyoLysis™ Buffer A for Metabolic Assay、检测缓冲液、显色液和底物，平衡至室温后混匀备用。其它试剂存放于冰浴备用，使用完毕后宜立即按照试剂盒要求的条件保存。
b.10mM NADPH标准溶液的配制：在本试剂盒提供的5mg NADPH中加入600μl检测缓冲液，充分溶解并混匀，即为10mM的NADPH标准溶液。除待用部分外，其余NADPH标准溶液适当分装后-80ºC避光保存。
c.显色工作液(Working Solution)的配制：按照每个检测反应80μl的体积配制适量的显色工作液。均匀混合74μl检测缓冲液(IDH Assay Buffer)、2μl显色液(Chromogen Solution)、2μl底物(Substrate)、2μl NAD+/NADP+，即可配制成80μl显色工作液(Working Solution)。根据待检测样品(包括标准品)的数量，配制适量的显色工作液。具体配制方法参考下表。配制好的显色工作液如果置于4ºC或冰浴避光保存，可以在当天使用，但建议尽量现配现用。

Samples	1	10	20	50
IDH Assay Buffer (μl)	74	740	1480	3700
Chromogen Solution (μl)	2	20	40	100
Substrate (μl)	2	20	40	100
* NAD+/NADP+ (μl)	2	20	40	100
Working Solution (μl)	80	800	1600	4000

*如需检测NAD+-IDH活性，则显色工作液中加入2μl NAD+；如需检测NADP+-IDH的活性，则显色工作液中加入2μl NADP+；如需检测总IDH的活性，则显色工作液中加入1μl NAD+和1μl NADP+ 。
注：当样品有背景会对检测产生干扰时，需同时设置样品背景对照孔，加入不含底物的显色工作液，即配制显色工作液时2µl底物用IDH检测缓冲液替代。计算时样品孔的读数值需要减去样品背景对照孔的读数。
3.样品测定：
a.NADPH标准曲线的设置：取10μl NADPH标准溶液(10mM)，加入90μl检测缓冲液，混匀，配制成浓度为1mM的NADPH标准溶液。分别取1mM的NADPH标准溶液0、2、4、8、12、16、20μl加入96孔板的标准品孔中，并用检测缓冲液补足到20μl，此时标准曲线的浓度为0、100、200、400、600、800、1000μM。注：此标准曲线也可以作为NAD-IDH检测时的标准曲线。
b.阳性对照的设置：用检测缓冲液将阳性对照(100X)做100倍的稀释，然后取20μl加入96孔板作为阳性样品。例如取阳性对照1μl，加入检测缓冲液99μl，混匀后取20μl加入96孔板作为阳性样品。
注：阳性对照可能会有不溶物析出，使用前请混匀。
c.取1-20μl稀释后的样品至96孔板样品孔中，并相应地再加入检测缓冲液至样品孔中，补足到20µl。同时设置仅含检测缓冲液的孔为空白对照孔。
注：为确保数值在标准曲线范围内，建议进行预实验将样品同时设定多个稀释倍数，以确定样品的大致浓度。如果数值不在标准曲线范围内，可调整样品的稀释倍数或者增加样品的用量。此处的样品总稀释倍数记为n (例如本步骤中对样品进行了10倍稀释，加入的“稀释后的样品”为10µl，则n=10×20/10=20)。
d.各孔加入显色工作液80μl，混匀。
e.立即使用适当的酶标仪或微量紫外分光光度计测定A450，此时记录为0分钟读值A1。
f.37ºC反应10-30分钟，反应时间记为T，测定A450，记为A2。信号的增强取决于异柠檬酸脱氢酶催化产生的NADH或NADPH的量，ΔA = A2 – A1。
注：为取得最佳的检测效果，反应时间可以根据待测样品中的异柠檬酸脱氢酶活性进行调整，但是必须确保读数在标准曲线范围内。对于异柠檬酸脱氢酶活性较高的样品，建议测定总时间为20分钟或30分钟，对应的测定间隔时间设为2分钟或5分钟；对于异柠檬酸脱氢酶活性较低的样品，可以延长测定总时间为1至2小时，对应的测定间隔时间设为10或20分钟。也可以连续测定30分钟，每隔1或2分钟测定1次，最后取呈线性的时间点前的数据用于分析和计算。
g.建立NADPH标准曲线，将ΔA代入标准曲线，即可算出在反应时间内样品中异柠檬酸脱氢酶催化产生的NADH或NADPH的浓度(记录为B)。NADPH标准曲线可以参考图2，在20-1000μM浓度范围内有良好的线性关系。样品异柠檬酸脱氢酶的活性计算公式如下：
Isocitrate dehydrogenase Activity (U/L) = B × n / T
注：B为步骤3g根据标准曲线确定的NADH或NADPH浓度(µM)；
n为步骤3c样品总稀释倍数；
T为步骤3f的反应时间(min)。
异柠檬酸脱氢酶活力单位的定义：1个酶活力单位(unit, U)在37ºC条件下，在1分钟内可以生成1µmol NADH或NADPH。
参考文献：
1.Zhu GP, Gloding GB, Dean AM. Science. 2005. 307(5713):1279-1282.
2.Lunzer M, Miller SP, Felsheim R, Dean AM. Science. 2005. 310(5747):499-501.
3.Al-Khallaf H. Cell Biosci. 2017. 7:37.
4.Jung LL, Kim SK, Kim IG. Curr Microbiol. 2006. 52(1):21-6.
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