使用说明：
1.试剂盒的准备。
a.融解Glucose Uptake Assay Buffer、Glucose Uptake Lysis Buffer、KRPH Buffer和2-DG (10mM)，平衡至室温后混匀备用。Glucose Uptake Reagent A、Glucose Uptake Reagent B和Enzyme Solution于融解后放置于冰浴备用，使用完毕后宜立即按照试剂盒要求的条件保存。
b.Glucose Uptake Detection反应工作液(Working Solution)的配制：按照每个反应50µl的体积配制适量的Glucose Uptake Detection反应工作液。均匀混合46µl Glucose Uptake Assay Buffer、2µl Glucose Uptake Reagent A、1µl Glucose Uptake Reagent B、1µl Enzyme Solution，即可配制成50µl Glucose Uptake Detection反应工作液。根据待检测样品(包括标准品)的数量，配制适量的Glucose Uptake Detection反应工作液。具体配制方法参考下表。配制好的Glucose Uptake Detection反应工作液如果置于4ºC或冰浴避光保存，可以在当天数小时内使用，但建议尽量现配现用。

Samples	1	10	20	50
Glucose Uptake Assay Buffer (µl)	46	460	920	2300
Glucose Uptake Reagent A (µl)	2	20	40	100
Glucose Uptake Reagent B (µl)	1	10	20	50
Enzyme Solution (µl)	1	10	20	50
Working Solution (µl)	50	500	1000	2500

注：由于Glucose Uptake Reagent A、Glucose Uptake Reagent B和Enzyme Solution的用量较少且易沉降，必须注意在加入后须适当混匀后再使用。
2.细胞样品的准备(以96孔板为例)。
本实验方案针对油酸诱导的HeLa细胞进行举例说明，油酸诱导方案仅供参考。对于其它类型的细胞如分化的3T3-L1脂肪细胞、肌肉细胞、肝脏细胞等，最佳孵育时间和处理方案可能会有所不同。
a.接种细胞。按照每孔1万个细胞量加入96孔板中，培养箱继续培养24小时。
b.油酸诱导HeLa细胞。PBS洗涤细胞1次，每孔加入100μl含有800μM油酸的完全培养液，培养箱继续培养24小时。推荐使用油酸(≥99%, Cell Culture Grade) (ST2053)。
c.PBS洗涤细胞2次，每孔加入100μl无血清低糖培养液，培养过夜。
注1：也可使用无糖培养液，使用无糖培养液处理不应超过6个小时，以避免造成细胞损伤。推荐碧云天的低糖或无糖DMEM培养液(C2712/C2715)或无糖RPMI 1640培养液(C2727)。
注2：对于分化的3T3-L1脂肪细胞等，仅需要无血清培养液饥饿处理即可。无血清培养时间可根据实际细胞状态进行调整。
d.次日，PBS洗涤细胞3次。每孔加入100μl KRPH Buffer，37ºC孵育40分钟，使细胞进一步缺乏葡萄糖。
注：步骤2a-2d仅供参考，对于具体拟检测的细胞样品，可以任意自行设置。
e.对照和样品组的设置。
(a)背景对照组。无需进行胰岛素或根皮素等处理，也无须加入2-DG。
注：必须设置背景对照组，以消除细胞内源性G6P、NADP+等的干扰。
(b)(选做)阳性和阴性对照组。加入胰岛素至合适的终浓度(如100μg/ml)作为阳性对照，或加入抑制剂(如终浓度为150μM的根皮素)作为阴性对照，孵育20分钟。随后加入10μl 2-DG (10mM)，孵育20分钟。
注1：加入胰岛素可刺激细胞快速摄取葡萄糖。
注2：产生胰岛素耐受的细胞在添加胰岛素刺激后，细胞的葡萄糖摄取能力会减弱。
(c)样品组。目的药物等处理适当时间后，加入10μl 2-DG (10mM)，孵育20分钟。
注：对于一些葡萄糖摄入比较缓慢的细胞，阳性和阴性对照组以及样品组加入2-DG后的孵育时间可以延长到例如60分钟，同时也可以考虑把2-DG的加入量加倍，即可以考虑加入20μl 2-DG (10mM)。通过上述两种操作可以提高葡萄糖摄取的检测灵敏度。
f.使用PBS洗涤细胞3次，每孔加入100μl Glucose Uptake Lysis Buffer，适当吹打，充分裂解细胞。4ºC，14,000×g离心5分钟，取上清用于后续检测。以上所有操作均需在4ºC或冰上操作，制备好的细胞裂解液样品如果不能立即检测，可以短期保存于-20ºC或-80ºC。推荐碧云天的BeyoFuge™ 1524R高速台式冷冻离心机(15000rpm, 24孔) (E6943)。
3.组织样品的准备。
a.实验动物处理和2-DG摄入。小鼠等实验动物进行适当的药物处理或遗传操作后注射或灌胃适量的2-DG，同时必须设置未注射或灌胃2-DG的背景对照组。同时推荐设置适当的阴性和阳性对照。推荐注射或灌胃等摩尔数的葡萄糖后不会显著影响血糖水平为宜，这样外源进入体内的2-DG对于体内正常的糖代谢干扰较小。
b.组织样品采集。根据具体的实验设计，可以酌情考虑在注射或灌胃2-DG例如30分钟、60分钟或120分钟后采集目的组织样品，同时采集背景对照组的组织样品。
c.组织样品的制备。使用Glucose Uptake Lysis Buffer按照1:10的比例(10mg组织样品使用100μl Glucose Uptake Lysis Buffer)进行匀浆和裂解，随后4ºC，14,000×g离心5分钟，取上清用于后续检测。推荐碧云天的BeyoFuge™ 1524R高速台式冷冻离心机(15000rpm, 24孔) (E6943)。
4.样品测定。
a.2-DG6P标准曲线设置：取10μl 2-DG6P Standard (10mM)，加入190μl Glucose Uptake Assay Buffer，混匀，配制成浓度为500μM的2-DG6P标准溶液。分别取500μM的2-DG6P标准溶液0、0.5、1、2.5、5、10、25、50μl加入96孔板的标准品孔中，并相应地用Glucose Uptake Assay Buffer补足至50μl，此时，标准曲线的浓度分别为0、5、10、25、50、100、250、500μM。
b.取1-50μl样品或稀释后的样品至96孔板样品孔中，并相应地加入Glucose Uptake Assay Buffer至样品孔中，补足至50µl。
注：为确保样品数值在标准曲线范围内，建议进行预实验将样品设置多个稀释倍数，以确定样品中2-DG6P的大致浓度，如果数值不在标准曲线范围内，请调整样品的稀释倍数或者样品的量。样品总稀释倍数记为n (例如本步骤中对样品进行了10倍稀释，加入的“稀释后的样品”为20µl，则n=10×50/20=25)。
c.每孔加入50μl Glucose Uptake Detection反应工作液，混匀，37ºC避光反应30分钟。
注：如果吸光度偏低，可适当延长反应时间，例如反应45或60分钟。
d.反应结束后，请在450nm处进行吸光度检测。
e.建立标准曲线，并计算样品中2-DG6P的浓度(A)，如果样品的背景对照信号比较高，样品的信号值应减去样品背景对照的信号值。2-DG6P标准曲线可以参考图2A，在1-500μM浓度范围内有良好的线性关系。2-DG摄取计算公式如下：
C(μM)=A×n
注：A为步骤3e根据标准曲线确定的2-DG6P浓度(μM)；
n为步骤3b样品总稀释倍数。
参考文献：
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8.Yamamoto N, Ashida H. Food Sci Technol Res. 2012. 18:498-503.
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