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D-乳酸脱氢酶检测试剂盒(WST-8法)
产品编号: P0392S
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P0392S D-乳酸脱氢酶检测试剂盒(WST-8法) 100次 308.00元

碧云天研发的D-乳酸脱氢酶检测试剂盒(WST-8法) (D-Lactate Dehydrogenase Assay Kit with WST-8, 简称D-LDH Assay Kit with WST-8)是一种基于WST-8的显色反应,通过比色法快速、高灵敏地对血清、血浆、尿液等生物体液、组织、细胞以及组织或细胞培养上清样品中D-乳酸脱氢酶活性进行检测的试剂盒。通常0. 1-1µl血清或血浆样品就足够用于本试剂盒的检测。本试剂盒检测的是NAD+依赖型的D-乳酸脱氢酶(NAD+-dependent D-lactate dehydrogenase)。

乳酸脱氢酶(Lactate Dehydrogenase, LDH)是绝大部分哺乳动物活细胞中都存在的酶,广泛存在于哺乳动物各个组织中,以心、骨骼肌和肾脏通常最为丰富,是临床心肌酶谱检查中的一项重要指标,可用于心肌疾病的辅助诊断。LDH催化乳酸(Lactate)生成丙酮酸(Pyruvate),同时伴随着NAD+到NADH的转化。由于其常在组织损伤期间释放(通常因为细胞膜失去完整性而导致细胞内LDH的释放),因此也被视作细胞坏死和常见损伤和相关疾病的生物标志物[1,2]。乳酸脱氢酶根据其结合的辅酶的不同,可以分为NAD+-依赖型乳酸脱氢酶(NAD+-dependent lactate dehydrogenase)和NAD+-非依赖型乳酸脱氢酶(NAD+-independent lactate dehydrogenase)。NAD+-依赖型乳酸脱氢酶分布更为广泛,在人体、动物以及微生物中都普遍存在。据乳酸脱氢酶的底物特异性,乳酸脱氢酶可以分为D-乳酸脱氢酶(D-Lactate Dehydrogenase, D-LDH)和L-乳酸脱氢酶(L-Lactate Dehydrogenase, L-LDH) [3]。

D-乳酸脱氢酶能催化D-乳酸(D-Lactate)与丙酮酸(Pyruvate)的相互转化[3,4]。D-乳酸脱氢酶是甲基乙二醛(Methylglyoxal, MGO)途径的重要酶,负责将该途经的终产物D-乳酸转化为丙酮酸,D-乳酸的过度积累可能导致D-乳酸酸中毒(D-lactic acidosis or D-lactate encephalopathy) [5]。此外,在食管鳞状细胞癌(Esophageal Squamous Cell Carcinoma, ESCC)的肿瘤干细胞(Cancer Stem Cells, CSCs)中,D-乳酸脱氢酶显著高表达,高水平的D-乳酸脱氢酶与ESCC患者的预后不良有关[6]。

本试剂盒的检测原理如图1所示。D-乳酸脱氢酶催化D-乳酸(D-Lactate)氧化生成丙酮酸(Pyruvate),在这一过程中NAD+还原为NADH;生成的NADH在电子耦合试剂1-mPMS (1-Methoxy-5-methylphenazinium methyl sulfate)的作用下将WST-8还原成橙黄色的甲瓒(Formazan),在450nm左右有最大吸收峰。催化生成的甲瓒的量与D-乳酸脱氢酶的活性呈正比,通过测定450nm处的吸光值可以非常灵敏地检测样品中D-乳酸脱氢酶的活性。

图1.碧云天D-乳酸脱氢酶检测试剂盒(WST-8法) (P0392)检测原理图。

本试剂盒检测灵敏度高,线性范围宽,样品用量少。本试剂盒能特异性检测D-乳酸脱氢酶,而不检测L-乳酸脱氢酶。在样品体积为50µl时,可以检测活性低至0.5mU/ml的D-乳酸脱氢酶,在0.5-100mU/ml活力范围内有良好的线性关系。本试剂盒提供了D-乳酸脱氢酶标准溶液,可以通过绘制标准曲线(图2A),计算出样品中D-乳酸脱氢酶的活性。如需检测L-乳酸脱氢酶和总乳酸脱氢酶的活性,推荐使用碧云天的L-乳酸脱氢酶检测试剂盒(WST-8法) (P0393)和总乳酸脱氢酶检测试剂盒(WST-8法) (P0395)。

图2.碧云天D-乳酸脱氢酶检测试剂盒(WST-8法) (P0392)对D-乳酸脱氢酶标准品、小鼠肌肉以及HeLa细胞样品的检测效果图。图A为本试剂盒对D-乳酸脱氢酶标准品的检测效果图,在0.5-100mU/ml范围内有良好的线性关系,并且对于L-乳酸脱氢酶的检测呈现阴性;图B为本试剂盒检测50mU/ml D-乳酸脱氢酶标准品、蛋白量为7.5μg的小鼠腿肌裂解样品(Mouse Muscle)、蛋白量为7.4μg的HeLa细胞裂解样品(HeLa Cell)时反应30分钟内的吸光值变化图。实际检测数据会因实验条件、检测仪器等的不同而存在差异,图中数据仅供参考。

本试剂盒提供的检测裂解液有一定的通用性。使用本试剂盒中的BeyoLysis™ Buffer A for Metabolic Assay裂解获得的细胞或组织样品,也可以用于碧云天生产的其它代谢类试剂盒中同样使用BeyoLysis™ Buffer A for Metabolic Assay进行裂解的样品检测,通用性强;还可用于检测蛋白浓度、进行SDS-PAGE或一些较易溶解蛋白的Western检测。

本试剂盒检测速度快、应用范围广。本试剂盒可用于小鼠、大鼠、人等的血清、血浆、尿液等生物体液,细胞培养上清、组织或细胞样品等的检测。整个检测过程约1小时即可完成。本试剂盒不仅适合少量样本的检测,也非常适合高通量筛选(High-throughput screening)的自动化操作系统。

按照使用说明操作,用于96孔板检测时,本试剂盒小包装可以进行100次检测。

包装清单:
产品编号 产品名称 包装
P0392S-1 BeyoLysis™ Buffer A for Metabolic Assay 20ml
P0392S-2 D-LDH Assay Buffer 20ml
P0392S-3 Substrate 200μl
P0392S-4 D-Lactate Solution (50X) 200μl
P0392S-5 WST-8 200μl
P0392S-6 D-Lactate Dehydrogenase (10U/ml) 50μl
说明书 1份
保存条件:

-20ºC保存,一年有效。其中WST-8须避光保存。

注意事项:

本试剂盒仅能检测D-乳酸脱氢酶,不能检测L-乳酸脱氢酶。

BeyoLysis™ Buffer A for Metabolic Assay、D-LDH Assay Buffer需要完全解冻并平衡至室温后再使用,否则会影响检测结果。其它溶液使用时应在冰上进行。

Substrate从-20ºC取出在融解过程中可能会有析出,平衡至室温后析出的部分会溶解,不会对检测结果产生影响。

血清、血浆等样品如果在4ºC保存,保存的时间不得超过2周,否则会影响检测结果的准确性。通常血清样品宜在-20ºC保存,-80ºC保存更佳。

本产品仅限于专业人员的科学研究用,不得用于临床诊断或治疗,不得用于食品或药品,不得存放于普通住宅内。

为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用说明:
1.样品的准备:
a.血液样品的准备:对于血清样品,将全血在常温如25ºC下放置30分钟-2小时,不要剧烈摇晃以免溶血,待全血自然凝固并析出血清后,4ºC约1000-2000×g离心10分钟,取黄色上清即得血清,注意不要吸取白色或淡黄色沉淀;对于血浆样品,将全血用肝素或者EDTA进行抗凝,4ºC约1000-2000×g离心10分钟,取黄色或淡黄色上清即得血浆,注意不要吸取白色沉淀。血清和血浆都需置于冰上,如果不能立即检测,也可以分装并短期保存于-20ºC或-80ºC。对于冻存的样品,在检测前解冻后冰浴存放备用,使用前必须混匀。
b.细胞或组织样品的准备:对于培养的贴壁细胞,PBS (C0221A)洗涤一次并吸净残留液体。对于培养的悬浮细胞,先适当离心(如100-500×g,5分钟)收集细胞到离心管内,弃上清并吸净残留液体。按照每100万细胞加入100-200μl BeyoLysis™ Buffer A for Metabolic Assay的比例加入裂解液,适当吹打,冰浴5-10分钟以充分裂解细胞。4ºC约12,000×g离心3-5分钟,取上清用于后续检测。对于组织样品,按照每10mg组织加入100μl BeyoLysis™ Buffer A for Metabolic Assay的比例,使用TissueMaster™高通量组织研磨仪(1.5/2ml×48) (E6618)、TissueMaster™手持式组织研磨仪(E6600/E6607)或玻璃匀浆器在约4ºC或冰浴等低温条件下进行匀浆。4ºC约12,000×g离心3-5分钟,取上清用于后续检测。以上所有操作均需在4ºC或冰上操作。制备好的细胞或组织样品如果不能立即检测,可以-20ºC或-80ºC冻存。
c.细胞培养上清样品的准备:对于贴壁细胞,直接取培养液;对于悬浮细胞,离心取培养液。
2.试剂盒的准备:
a.融解BeyoLysis™ Buffer A for Metabolic Assay、D-LDH Assay Buffer,平衡至室温后混匀备用。其它试剂存放于冰浴备用,使用完毕后宜立即按照试剂盒要求的条件保存。
b.WST-8显色工作液(WST-8 Working Solution)的配制:按照每个反应50µl的体积配制适量的显色工作液。均匀混合44µl D-LDH Assay Buffer、2µl Substrate、2µl D-Lactate Solution、2µl WST-8,即可配制成50µl WST-8显色工作液。根据待检测样品(包括标准品)的数量,配制适量的WST-8显色工作液。具体配制方法参考下表。配制好的WST-8显色工作液如果置于4ºC或冰浴避光保存,可以在当天使用,但建议尽量现配现用。
Samples 1 10 20 50
D-LDH Assay Buffer (µl) 44 440 880 2200
Substrate (µl) 2 20 40 100
D-Lactate Solution (µl) 2 20 40 100
WST-8 (µl) 2 20 40 100
WST-8 Working Solution (µl) 50 500 1000 2500
注:NADH和NADPH以及会影响NADH和NADPH水平的物质等的存在会对D-乳酸脱氢酶的检测产生干扰。如果样品含有干扰物质,须同时设置样品的背景对照孔,加入不含D-Lactate Solution的WST-8显色工作液,即配制WST-8显色工作液时2µl D-Lactate Solution用D-LDH Assay Buffer替代。计算时样品孔的读数值需要减去背景对照孔的读数。
3.样品测定:
a.D-乳酸脱氢酶标准曲线的设置。
取2μl D-Lactate Dehydrogenase (10U/ml),加入198μl D-LDH Assay Buffer,混匀,配制成100mU/ml D-乳酸脱氢酶标准溶液。分别取100mU/ml的D-乳酸脱氢酶标准溶液0、0.25、0.5、1、2.5、5、10、25、50μl加入96孔板的标准品孔中,并用D-LDH Assay Buffer补足至50μl,此时,标准曲线的浓度分别为0、0.5、1、2、5、10、20、50、100mU/ml。
注:由于酶溶液的用量较少且易沉降,必须注意在使用前先轻轻离心一下,然后适当混匀后再使用。
b.取1-50μl样品或稀释后的样品至96孔板样品孔中,并加入D-LDH Assay Buffer至样品孔中,补足至50µl。同时设置仅含D-LDH Assay Buffer的孔为空白对照。
注:为确保样品数值在标准曲线范围内,建议进行预实验将样品设置多个稀释倍数,以确定样品中D-乳酸脱氢酶的大致活性,如果数值不在标准曲线范围内,请调整样品的稀释倍数或者样品的量。样品总稀释倍数记为n (例如本步骤中对样品进行了10倍稀释,加入的“稀释后的样品”为25µl,则n=10×50/25=20)。
c.各孔加入WST-8显色工作液50µl,混匀。
d.立即使用适当的酶标仪在450nm测定吸光度。此时记录0分钟读值为A1。
e.37ºC反应20-30分钟,测定A450,记为A2。吸光值的升高取决于D-乳酸脱氢酶的活性,ΔA = A2 - A1。
注:为取得最佳的检测结果,反应时间可以根据待测样品中的D-乳酸脱氢酶活性进行调整,但必须确保读数在标准曲线的范围内。对于D-乳酸脱氢酶活性较高的样品,建议测定总时间为20或30分钟,对应的测定间隔时间设为2分钟或5分钟。对于D-乳酸脱氢酶活性较低的样品,可以延长测定总时长为1小时,对应的测定间隔时间设为10或20分钟;也可以连续测定30分钟,每隔1或2分钟测定1次,最后取呈线性的时间点前的数据用于分析或计算。
f.建立D-乳酸脱氢酶标准曲线,将ΔA代入标准曲线,即可计算出反应时间内样品中D-乳酸脱氢酶的活性B。D-乳酸脱氢酶标准曲线可以参考图2A,在0.5-100mU/ml范围内有良好的线性关系。D-LDH活性计算公式如下:
D-LDH Activity (mU/ml) = B × n
注:B为步骤3f中根据标准曲线确定的D-LDH活性(mU/ml);
n为步骤3b中样品总稀释倍数。
D-乳酸脱氢酶酶活力单位的定义:1个酶活力单位(unit, U)在25或37ºC,pH7.0的条件下,在1分钟内可以催化生成1µmol丙酮酸。
参考文献:
1.Markert CL. Cell Biochem Funct. 1984. 2(3):131-4.
2.Feng Y, Xiong Y, Qiao T, Li X, Jia L, et al. Cancer Med. 2018. 7(12):6124-6136.
3.Cristescu ME, Innes DJ, Stillman JH, Crease TJ. BMC Evol Biol. 2008. 8:268.
4.Razeto A, Kochhar S, Hottinger H, Dauter M, Wilson KS, et al. J Mol Biol. 2002. 318(1):109-119.
5.Ewaschuk JB, Naylor JM, Zello GA. J Nutr. 2005. 135(7):1619-1625.
6.Lv M, Gong Y, Liu X, Wang Y, Wu Q, et al. Signal Transduct Target Ther. 2023. 8(1):302.
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