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果糖-6-磷酸检测试剂盒(WST-8法)
产品编号: S0183S
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S0183S 果糖-6-磷酸检测试剂盒(WST-8法) 100次 1198.00元

碧云天研发的果糖-6-磷酸检测试剂盒(WST-8法) (Fructose-6-phosphate Assay Kit with WST-8),也称6-磷酸果糖检测试剂盒(WST-8法)或F6P Assay Kit with WST-8,是一种基于WST-8的显色反应,通过比色法,快速、高灵敏地对组织或细胞样品、血清和血浆等生物体液以及组织或细胞培养上清样品中果糖-6-磷酸含量进行检测的试剂盒。

果糖-6-磷酸(Fructose-6-phosphate, F6P),也称6-磷酸果糖,分子式为C6H13O9P,分子量为260.13,是果糖的磷酸化产物。F6P是细胞代谢的重要代谢中间产物,在糖酵解途径中,葡萄糖-6-磷酸(Glucose-6-phosphate, G6P)被磷酸葡萄糖异构酶(Phosphoglucose isomerase, PGI)异构化为F6P,F6P在启动糖原合成中发挥作用,同时也参与己糖胺途径和己糖单磷酸分流通路[1]。此外,F6P也参与磷酸戊糖途径(Pentose Phosphate Pathway, PPP)的非氧化分支,以生成用于核苷酸合成的戊糖磷酸和用于芳香族氨基酸自养型生物(Aromatic amino acid autotrophs)中各种芳香族代谢物和组氨酸生物合成的前体4-磷酸赤藓糖(Erythrose 4-phosphate) [2]。

本试剂盒的检测原理请参考图1。果糖-6-磷酸(F6P)被磷酸葡萄糖异构酶(PGI)异构化为葡萄糖-6-磷酸(G6P),生成的葡萄糖-6-磷酸在葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(Glucose-6-phosphate dehydrogenase, G6PDH)的作用下氧化生成6-磷酸葡萄糖酸内酯(6-phosphogluconate, 6-PG),在这一反应过程中NADP+被还原为NADPH;生成的NADPH在电子耦合试剂(Electron mediator)的作用下将WST-8还原生成橙黄色的Formazan,在450nm左右有最大吸收峰。反应体系中生成的Formazan与样品中果糖-6-磷酸的含量成正比。

图1.碧云天果糖-6-磷酸检测试剂盒(WST-8法) (S0183)检测原理图。

本试剂盒检测灵敏度高,线性范围宽,样品用量少。本试剂盒在样品体积为20µl时可以检测浓度低达5μM的果糖-6-磷酸,在5-2000μM (0.1-40nmol)浓度范围内有良好的线性关系。本试剂盒提供了果糖-6-磷酸标准溶液,可以通过设置标准曲线(图2),从而计算出样品中的果糖-6-磷酸含量。

图2.碧云天果糖-6-磷酸检测试剂盒(WST-8法) (S0183)检测果糖-6-磷酸标准品的标准曲线。各浓度果糖-6-磷酸标准品加入WST-8显色工作液后,37℃孵育20分钟,测定A450,在5-2000μM浓度范围内有良好的线性关系。实际检测数据会因实验条件、检测仪器等的不同而存在差异,图中数据仅供参考。

本试剂盒提供的检测裂解液有一定的通用性。使用本试剂盒中的BeyoLysis™ Buffer A for Metabolic Assay裂解获得的细胞或组织样品,也可以用于碧云天生产的其它代谢类试剂盒中同样使用BeyoLysis™ Buffer A for Metabolic Assay进行裂解的样品检测,通用性强;而且还可用于检测蛋白浓度、进行SDS-PAGE或一些较易溶解蛋白的Western检测。

本试剂盒使用灵活,检测速度快,适用范围广。本试剂盒可用于小鼠、大鼠、人等的血清、血浆、尿液等生物体液,细胞培养上清、组织或细胞样品等样品的检测,全程约0.5-1小时即可完成。本试剂盒不仅适合少量样品的检测,也非常适合高通量筛选(High-throughput screening)的自动化操作系统。

按照使用说明操作,用于96孔板检测时,本试剂盒小包装可以进行100次检测。

包装清单:
产品编号 产品名称 包装
S0183S-1 BeyoLysis™ Buffer A for Metabolic Assay 20ml
S0183S-2 F6P Assay Buffer 20ml
S0183S-3 Substrate 200μl
S0183S-4 Enzyme Solution A 200μl
S0183S-5 Enzyme Solution B 200μl
S0183S-6 WST-8 200μl
S0183S-7 F6P Standard (100mM) 200μl
说明书 1份
保存条件:

-20ºC保存,一年有效。其中WST-8须避光保存。

注意事项:

BeyoLysis™ Buffer A for Metabolic Assay、F6P Assay Buffer和Substrate需要完全解冻并平衡至室温后再使用,否则会影响检测结果。其它溶液使用时应在冰上进行。

Substrate从-20ºC取出在融解过程中可能会有析出,平衡至室温后析出的部分会复溶,不会对检测结果产生影响。

血清等样品如在4ºC保存,保存时间不得超过2周,否则会影响检测结果的准确性。通常血清样品宜-20ºC保存,-80ºC保存更佳。

本产品仅限于专业人员的科学研究用,不得用于临床诊断或治疗,不得用于食品或药品,不得存放于普通住宅内。

为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用说明:
1.样品的准备。
a.血液样品的准备:对于血清样品,将全血在常温如25ºC下放置30分钟至2小时,不要剧烈摇晃以免溶血,待全血自然凝固并析出血清后,4ºC约1000-2000×g离心10分钟,取黄色上清即得血清,注意不要吸取白色或淡黄色沉淀;对于血浆样品,将全血用肝素或者EDTA进行抗凝,4ºC约1000-2000×g离心10分钟,取黄色或淡黄色上清即得血浆,注意不要吸取白色沉淀。血清和血浆都需置于冰上,如果不能立即检测,也可以分装并短期保存于-20ºC或-80ºC。对于冻存的样品,在检测前解冻后冰浴存放备用,使用前必须混匀。
b.细胞或组织样品的准备:对于培养的贴壁细胞,PBS (C0221A)洗涤一次并吸净残留液体。对于培养的悬浮细胞,先适当离心(如100-500×g, 5分钟)收集细胞到离心管内,弃上清并吸净残留液体。按照每100万细胞加入100-200μl BeyoLysis™ Buffer A for Metabolic Assay的比例加入裂解液,适当吹打,冰浴5-10分钟以充分裂解细胞。4ºC约12,000×g离心3-5分钟,取上清用于后续检测。对于组织样品,按照每10mg组织加入100μl BeyoLysis™ Buffer A for Metabolic Assay的比例,使用TissueMaster™高通量组织研磨仪(1.5/2ml×48) (E6618)、TissueMaster™手持式组织研磨仪(E6600/E6607)或玻璃匀浆器在约4ºC或冰浴等低温条件下进行匀浆。4ºC约12,000×g离心3-5分钟,取上清用于后续检测。以上所有操作均需在4ºC或冰上操作。制备好的细胞或组织样品如果不能立即检测,可以-20ºC或-80ºC冻存。
c.细胞培养上清样品的准备:对于贴壁细胞,直接取培养液;对于悬浮细胞,离心取培养液。
2.试剂盒的准备。
a.融解BeyoLysis™ Buffer A for Metabolic Assay、F6P Assay Buffer和Substrate,平衡至室温后混匀备用。其它试剂存放于冰浴备用,使用完毕后宜立即按照试剂盒要求的条件保存。
b.WST-8显色工作液(WST-8 Working Solution)的配制:按照每个检测反应80μl的体积配制适量的WST-8显色工作液。均匀混合72μl F6P Assay Buffer、2μl Substrate、2μl Enzyme Solution A、2μl Enzyme Solution B、 2μl WST-8,即可配制成80μl WST-8显色工作液。根据待检测样品(包括标准品)的数量,配制适量的WST-8显色工作液。具体配制方法参考下表。配制好的WST-8显色工作液如果置于4ºC或冰浴避光保存,可以在当天使用,但建议尽量现配现用。
Samples 1 10 20 50
F6P Assay Buffer (μl) 72 720 1440 3600
Substrate (μl) 2 20 40 100
Enzyme Solution A (µl) 2 20 40 100
Enzyme Solution B (µl) 2 20 40 100
WST-8 (μl) 2 20 40 100
WST-8 Working Solution (μl) 80 800 1600 4000
注1:由于酶溶液的用量较少且易沉降,必须注意在使用前先轻轻离心一下,然后适当混匀后再使用。
注2:葡萄糖-6-磷酸、NADH、NADPH等的存在会对果糖-6-磷酸的检测产生干扰。如果样品含有葡萄糖-6-磷酸、NADH、NADPH,须同时设置样品背景对照孔,加入不含Enzyme Solution A的显色工作液,即配制WST-8显色工作液时2µl Enzyme Solution A用F6P Assay Buffer替代。计算时样品孔的读数需要减去样品背景对照孔的读数。
3.样品测定。
a.果糖-6-磷酸标准曲线设置。
取2μl F6P Standard (100mM),加入98μl F6P Assay Buffer,混匀,配制成浓度为2mM的果糖-6-磷酸标准溶液。分别取2mM的果糖-6-磷酸标准溶液0、0.5、1、2、5、10、20μl加入96孔板的标准品孔中,并用F6P Assay Buffer补足到20μl,此时标准曲线的浓度为0、50、100、200、500、1000、2000μM。
b.加入1-20μl样品或稀释后的样品到96孔板样品孔中,并相应地再加入F6P Assay Buffer至样品孔中,补足到20µl。同时设置仅含F6P Assay Buffer的孔为空白对照孔。
注:为确保数值在标准曲线范围内,建议进行预实验将样品同时设定多个稀释倍数,以确定样品中果糖-6-磷酸的大致浓度。如果数值不在标准曲线范围内,可调整样品的稀释倍数或者样品的量。样品总稀释倍数记为n (例如本步骤中对样品进行了10倍稀释,加入的“稀释后的样品”为5µl,则n=10×20/5=40)。
c.各孔加入WST-8显色工作液80μl,混匀,37ºC避光反应20分钟。
注:如果吸光度偏低,可适当延长反应时间,例如反应30或45分钟。
d.在450nm测定吸光度。
e.建立标准曲线,并计算样品中果糖-6-磷酸的浓度(记录为A),如果样品背景对照孔吸光度比较高,样品的吸光度需要减去样品背景对照的吸光度。果糖-6-磷酸标准曲线可以参考图2,在5-2000μM浓度范围内有良好的线性关系。果糖-6-磷酸浓度的计算公式如下:
C (μM)=A×n
注:A为步骤3e根据标准曲线确定的稀释后的样品果糖-6-磷酸浓度(μM);
n为步骤3b样品总稀释倍数;
可根据果糖-6-磷酸的分子量260.13计算出样品中果糖-6-磷酸的质量浓度(μg/ml)=C×0.26013。
参考文献:
1.Donthi RV, Ye G, Wu C, McClain DA, Lange AJ, et al. J Biol Chem. 2004. 279(46):48085-48090.
2.Stincone A, Prigione A, Cramer T, Wamelink M. M, Campbell K, et al. Biol Rev Camb Philos Soc. 2015. 90(3):927-963.
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