Western，也称Western blot、Western blotting、Western印迹，常简写为WB，是用抗体检测蛋白表达的重要方法之一。

无论是Western高手，还是第一次做Western的小白，我们都优先推荐选用碧云天整合20多年技术积累的BeyoWB™超快速Western系列产品，可以在达到常规Western检测效果的基础上，极大的缩短Western实验时间。碧云天提供从样品到蛋白条带仅需80min的BeyoWB™ 80分钟电泳转膜与Western检测试剂盒 (P0002)、从膜到条带仅需30min的BeyoWB™ 30分钟Western检测试剂盒(P0001/P0956/P0958)，以及从膜到条带仅需10min的内参或标签蛋白Western检测试剂盒(P0970/P0971/P0972，P0981-P0997)，可满足不同的实验需求。

超快速电泳转膜与Western检测试剂盒，从样品到蛋白条带仅需80min：

碧云天提供可实现从样品到Western蛋白条带仅需80min的BeyoWB™ 80分钟电泳转膜与Western检测试剂盒(P0002)，检测效果与常规Western相近甚至更优，仅需自备一抗、二抗、水、无水乙醇及电泳、转印和成像设备即可，无气味上样缓冲液、预制胶、预裁切PVDF膜、转膜海绵垫等试剂盒都一并提供。用户仅需确保一抗和二抗之前常规Western能检测到目的条带即可，对仪器设备无特殊要求。使用试剂盒提供的4-20%的预制胶180V恒压电泳仅需25分钟；转膜无需冰浴，室温仅需10分钟即可高效完成蛋白转膜，转膜10分钟后温度仅升高5-10ºC；从完成转印的膜到获得目的蛋白条带仅需30分钟，总计通常不超过80分钟就能实现从样品到目的蛋白条带。

转膜后Western超快速检测试剂盒，从膜到条带仅需30min：

转膜完毕后使用碧云天BeyoWB™ 30分钟Western检测试剂盒(P0001)，能够有效加快封闭及抗体孵育时间，封闭时间仅需5分钟，一抗孵育15分钟，二抗孵育5分钟，每次洗涤仅需30秒，检测效果与常规Western相近甚至更优。用户仅需自备常规Western能检测到目的条带的一抗和二抗，无须特殊仪器设备，30分钟内即可快速获得与传统Western检测效果相当甚至更优的结果。此外，碧云天还提供包含二抗的BeyoWB™ 30分钟Western检测试剂盒(小鼠一抗用) (P0956)和BeyoWB™ 30分钟Western检测试剂盒(兔一抗用) (P0958)，用户仅需自备一抗即可。一抗和二抗工作液还可回收并重复使用，能够有效降低实验成本。

转膜后内参及标签蛋白Western超快速检测试剂盒，从膜到条带仅需10min：

对于内参蛋白Actin/GAPDH/Tubulin和标签蛋白Flag/HA/Myc/His/His (C-terminal)/GFP/GST/V5/MBP/StrepⅡ/AVI，可以考虑使用碧云天内参及标签蛋白Western超快速检测试剂盒(P0970/P0971/P0972，P0981-P0997)，封闭时间仅需1分钟，一抗和二抗孵育合并为一步操作，仅需5分钟即可完成抗体孵育。试剂盒包含从封闭到化学发光的整套试剂，转膜完成后通常10分钟就可以得到高质量的Western结果，可以极大加快Western实验的检测速度。抗体工作液，可以在4℃保存和使用不少于1个月，并且可以重复使用，有效降低实验成本。

Western可以参考如下步骤进行操作。

1. 收集蛋白样品(Protein sample preparation)

根据实验需要，使用适当的裂解液裂解贴壁细胞、悬浮细胞或组织样品，例如碧云天生产的Western及IP细胞裂解液(P0013/P0013J)、Western及IP细胞完全裂解液(P0037)、RIPA裂解液(P0013B/P0013C/P0013D/P0013K)、RIPA完全裂解液(P0038/P0039/P0040)、NP-40裂解液(P0013F)或SDS裂解液(P0013G)等，与普通裂解液相比，完全裂解液系列产品添加了除粘增溶剂，可有效消除普通裂解液在提取细胞和组织样品时可能出现的絮状或粘稠状物。此外，对于植物蛋白样品的提取，推荐使用碧云天生产的植物Western及IP细胞裂解液(P0043)、植物RIPA裂解液(强)(P0045)。对于活性蛋白抽提，碧云天生产了针对细菌，哺乳动物和昆虫样品的BeyoLytic™活性蛋白抽提试剂(P0013Q/P0013M/P0013S)。也可以使用BeyoSonicator™一体式智能超声波细胞破碎仪(650W) (E6926)进行细胞的破碎。

为了防止蛋白的降解，或保证磷酸化或乙酰化蛋白的稳定，样品裂解时也可额外添加蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂或去乙酰化酶抑制剂混合物(P1005/P1006/P1045/P1046/P1112/P1113)。

对于某些特定的亚细胞组份蛋白，例如细胞核蛋白、细胞浆蛋白、线粒体蛋白等，可以参考相关文献提取这些亚细胞组份蛋白，也可以使用试剂盒进行抽提，例如碧云天生产的细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒(P0027和P0028)、细胞膜蛋白与细胞浆蛋白提取试剂盒(P0033)、细胞线粒体分离试剂盒(C3601)、组织线粒体分离试剂盒(C3606)。

动物组织、植物组织、微生物样品等可采用TissueMaster™高通量组织研磨仪(1.5/2ml×48) (E6618)或者TissueMaster™手持式组织研磨仪(E6600/E6607)研磨和匀浆。

收集完蛋白样品后，为确保每个蛋白样品的上样量一致，需要测定每个蛋白样品的蛋白浓度。根据所使用的裂解液的不同，需要采用适当的蛋白浓度测定方法。因为不同的蛋白浓度测定方法对于一些去垢剂和还原剂等的兼容性差别很大。如果使用碧云天生产的Western及IP细胞(完全)裂解液(P0013/P0013J/P0037)、RIPA(完全)裂解液(P0013B/P0013C/P0013D/P0013K/ P0038/P0039/P0040)，可以使用BeyoBCA蛋白浓度快速测定试剂盒(P0398)进行蛋白的快速定量，也可使用BCA蛋白浓度测定试剂盒(P0009/P0010/P0011/P0012)、Bradford蛋白浓度测定试剂盒(去垢剂兼容型) (P0006C)；如果蛋白样品浓度较低，推荐使用BeyoBCA蛋白浓度测定试剂盒(高灵敏度) (P0399)。

2. 电泳(Electrophoresis)

(1) SDS-PAGE凝胶配制

SDS-PAGE凝胶可以参考一些文献资料进行配制，也可以使用碧云天生产的SDS-PAGE凝胶配制试剂盒(P0012A)、SDS-PAGE凝胶快速配制试剂盒(P0012AC)、SDS-PAGE凝胶超快速配制试剂盒(P0686-P0695)、SDS-PAGE凝胶一步法配制试剂盒(红色上层胶) (P0901)、SDS-PAGE凝胶一步法快速配制试剂盒(红色上层胶) (P0903)。其中最优先推荐使用SDS-PAGE凝胶一步法快速配制试剂盒(红色上层胶)(P0903)，集成了碧云天的多种最新凝胶配制技术，配制特别便捷，使用效果好。

为了方便上样，判断上样孔是否歪曲或破损，碧云天研发生产了不随电泳迁移的PAGE上层胶蓝/红/黄色染料(500X, 无迁移)(P0710/P0712/P0715)和可以随电泳迁移的PAGE上层胶蓝/红色染料(500X) (P0701/P0705)。 对经常使用固定凝胶浓度的情况，推荐使用碧云天的6%/8%/10%/12%/15% SDS-PAGE凝胶一步法超快速配制试剂盒(红色上层胶) (P0912/P0915/P0917/P0919/P0921)。

凝胶配制也可以使用碧云天生产的SDS-PAGE上层胶预混液(P0683)、SDS-PAGE下层胶预混液(P0670-P0678)、SDS-PAGE一步法红色上层胶预混液(P0906)、SDS-PAGE一步法蓝色上层胶预混液(P0908)、6%/8%/10%/12%/15% SDS-PAGE一步法下层胶预混液(P0932-P0943)、SDS-PAGE凝胶一步法超快速配制试剂盒(红色上层胶)(P0912-P0921)。

对于对蛋白分子量或凝胶体系有特殊要求的情况，碧云天也提供Bis-Tris-PAGE凝胶配制试剂盒(P0870)、Tricine-SDS-PAGE凝胶配制试剂盒(小分子量蛋白用)(P0531)、Tris-Acetate-PAGE凝胶配制试剂盒(大分子量蛋白用)(P0534)以及Blue Native PAGE凝胶配制试剂盒(P0543)。

配胶器具可以使用碧云天生产的MiniProGel™蛋白制胶与电泳系统(4胶)(E6001)、MiniProGel™蛋白制胶与电泳系统(2胶)(E6005)。如果不需要购买整套制胶器具，制胶配件如玻璃板、电泳梳、制胶架、夹胶框(E6011/E6012/E6013/E6015/E6030/E6032)等可单独购买。

如果希望免去凝胶配制的麻烦，可以使用碧云天的各种浓度规格的预制胶产品，如BeyoGel™ Elite PAGE预制胶(Tris-Gly) (P0808-P0829)、BeyoGel™ Elite PAGE预制胶(Bis-Tris) (P0846-P0867)、BeyoGel™ Plus PAGE预制胶(Tris-Gly) (P0448-P0472)、BeyoGel™ Plus PAGE预制胶(Hepes) (P0501-P0528)、BeyoGel™ SDS-PAGE预制胶(Tris-Gly, 12孔) (P0050-P0058)、BeyoGel™小分子量蛋白预制胶(Tricine, 16.5%) (P0532/P0533)、BeyoGel™大分子量蛋白预制胶(Tris-Acetate) (P0535/ P0536/P0538/ P0539)、BeyoGel™ Blue Native PAGE预制胶(4-13%) (P0545/P0546)。

针对BeyoGel™ Elite PAGE预制胶(Tris-Gly) (P0808-P0829)和BeyoGel™ Elite PAGE预制胶(Bis-Tris) (P0846-P0867)等塑料板预制胶系列产品，碧云天同时提供BeyoGel™预制胶开胶器(FGO021)，主要用于塑料板预制胶电泳后的胶板分离，也可用于其它品牌的塑料胶板预制胶。

(2) 样品处理

在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。例如2X或5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。使用5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以减小上样体积，在相同体积的上样孔内可以上样更多的蛋白样品。5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以参考相关文献资料配制，也可以使用碧云天生产的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(5X)(P0015)或SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(5X) (P0015L)。如果需要使用更少的上样缓冲液，也可以使用SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(6X) (P0015F)。如果是非变性样品，可以使用非变性PAGE蛋白上样缓冲液 (P0016)或非变性非还原性蛋白上样缓冲液 (P0016N)。细胞样品也可以直接使用SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(1X) (P0015A)或SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(1X, 含除粘增溶剂) (P0015G)裂解后上样。碧云天同时提供变性非还原性蛋白上样缓冲液(5X) (P0016P)、SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(5X, 不含溴酚蓝) (P0015N)等，满足一些特殊需求。

对于Bis-Tris和Tris-Acetate等体系的聚丙烯酰胺凝胶电泳，推荐使用BeyoGel™ LDS Sample Buffer (4X) (P0731)、BeyoGel™ Sample Reducing Agent (10X) (P0733)和BeyoGel™ Antioxidant (400X) (P0737)。 如果希望能即时观察蛋白电泳后的条带效果可以使用碧云天生产的 InstantView™ SDS-PAGE蛋白染色及上样缓冲液(5X) (P0280)；如需实现Western转膜后的泳道示踪，可以选择碧云天生产的双色SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(5X) (P0285)或红色SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(5X) (P0283)。

如果比较注重健康，不希望有DTT等巯基试剂的气味，推荐使用碧云天的无气味系列SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(P0286/P0287/P0288/P0289)。对于非变性样品，可以使用碧云天无气味系列非变性上样缓冲液(P0292)。即时观察蛋白电泳后的条带效果可以使用InstantView™ SDS-PAGE蛋白染色及上样缓冲液(5X，无气味) (P0281)；需要转膜后的泳道示踪可以使用碧云天无气味系列双色SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(P0295/P0296/P0297/P0298)，如果是非变性样品，可以使用双色非变性PAGE蛋白上样缓冲液(5X, 无气味)(P0299)。

最优先推荐使用双色SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(5X, 无气味) (P0295)，使用效果好，绿色环保，能有效进行泳道示踪，并提供免费试用装(P0295FT)。

金属浴或沸水浴加热3-5分钟，以充分变性蛋白。对于无气味的上样缓冲液，建议95℃水浴或PCR仪加热5分钟。推荐BeyoBath™干式恒温金属浴(1.5/2ml×40) (E6662)。

(3) 上样与电泳

蛋白样品冷却到室温后，直接上样到SDS-PAGE胶加样孔内即可。

碧云天提供各种预染蛋白质分子量标准用于观察电泳效果和转膜效果，以及判断蛋白分子量大小。推荐使用彩色预染蛋白质分子量标准(P0066/P0067/P0068/P0069/P0071/P0072/P0075/P0076/P0077/P0078/P0079/P0080)或非预染蛋白质分子量标准(P0060/P0061/P0062/P0063)。

Western和常规的SDS-PAGE实验可以考虑选购BeyoColor™彩色预染蛋白分子量标准(10-170kD)(P0075/P0076/P0077)。如目的蛋白的分子量大约在15-120kD范围内，那么选购BeyoColor™彩色预染蛋白分子量标准(15-120kD)(P0078/P0079/P0080)是非常理想的选择。如果科研经费非常宽裕，以获取最理想的蛋白marker为目标，Western和常规的SDS-PAGE，推荐选购BeyoColor™彩色预染蛋白分子量标准(6.5-270kD)(P0071/P0072)和彩色预染蛋白质分子量标准(10-180kD) (P0068/P0069)。对于SDS-PAGE实验希望可以精确判断分子量推荐选购Protein Ladder (10-200kD) (P0063)，常规的SDS-PAGE实验可以考虑选购蛋白质分子量标准(10-150kD) (P0060)。

碧云天提供适用于Tris-Gly、Hepes、Bis-Tris、Tris-Tricine等常见凝胶系统的电泳缓冲液产品。

对于Tris-Gly缓冲体系，推荐使用碧云天生产的SDS-PAGE电泳液(Tris-Gly) (P0014A/P0014B/P0014C/P0014D)或SDS-PAGE快速电泳液(Tris-Gly) (P0561/P0562)。最优先推荐使用能够有效加快蛋白电泳速率，缩短电泳时间的BeyoWB™ SDS-PAGE电泳液(Tris-Gly, 20X) (P0967)和SDS-PAGE快速电泳液(Tris-Gly) (P0561/P0562)。对于蛋白的非变性凝胶电泳推荐使用碧云天生产的非变性PAGE电泳液(P0014F/G)。

对于Hepes缓冲体系，推荐使用BeyoGel™ Plus SDS-PAGE Hepes电泳液(20X) (P0552)或BeyoGel™ Plus PAGE预制胶系列产品的BeyoGel™ Plus Native-PAGE Hepes电泳液(20X) (P0556)。

对于Bis-Tris缓冲体系，推荐使用BeyoGel™ MOPS SDS Running Buffer (P0741/P0743)或BeyoGel™ MES SDS Running Buffer (P0745/P0747)。

对于Tris-Tricine-SDS-PAGE，推荐使用碧云天生产的BeyoGel™ Tricine-SDS阴极/阳极电泳缓冲液(10X) (P0751/P0752)，是碧云天专门为BeyoGel™小分子量蛋白预制胶(P0532S/P0533S)研制的配套电泳液。 对于BeyoGel™大分子量蛋白预制胶，推荐使用专用的配套电泳液BeyoGel™ Tris-乙酸SDS电泳缓冲液(20X) (P0749)。

对于Blue Native PAGE ，推荐使用BeyoGel™ Blue Native PAGE阴极电泳缓冲液(5X) (P0765/P0767)和BeyoGel™ Blue Native PAGE阳极电泳缓冲液(5X) (P0769)，电泳液经过优化，完美匹配BeyoGel™ Blue Native PAGE Sample Buffer (2X) (P0761)、BeyoGel™ Blue Native PAGE预制胶(P0545/P0546)，配套使用能有效分离膜蛋白复合物。

电泳时通常推荐在上层胶时使用低电压恒压电泳，而在溴酚蓝进入下层胶时使用高电压恒压电泳。对于碧云天等品牌的标准电泳装置或类似电泳装置，通常低电压可以设置在80-100V，高电压可以设置在120V左右。蛋白电泳推荐使用碧云天的MiniProGel™蛋白制胶、电泳与转膜系统(E6150/E6155/E6159)，电泳仪推荐使用碧云天的BeyoPower™ 中电流电源(300V/600mA/100W) (E6080)或BeyoPower™ 高电流电源(300V/2000mA/200W) (E6085)。为了电泳方便起见，也可以采用整个SDS-PAGE过程恒压的方式，通常把电压设置在100V，然后设定定时时间为90-120分钟。设置定时可以避免经常发生的电泳过头。使用超快速电泳液时，请按照超快速电泳液的使用说明进行。

通常电泳时溴酚蓝到达胶的底端处附近即可停止电泳，或者可以根据预染蛋白质分子量标准的电泳情况，预计目的蛋白已经被适当分离后即可停止电泳。

3. 转膜(Transfer)

我们推荐在Western实验中选用PVDF膜

(FFP24/FFP26/FFP28/FFP32/FFP33/FFP36/FFP39/FFP70/FFP71/FFP73/FFP77/FFP78/FFP80),其中最优先推荐使用PVDF膜(进口分装，6.6×8.5cm, 0.45μm) (FFP32/FFP33)。PVDF膜在使用前须经浸润和活化，推荐使用碧云天生产的安全无毒的PVDF膜浸润活化液(P0021)，或选用碧云天的亲水PVDF膜(FFP19/FFP20/FFP22)，可直接被水溶液润湿，无须在乙醇、甲醇或其它溶液中浸泡活化。也可以使用硝酸纤维素膜(NC膜) (FFN02/FFN03/FFN05/ FFN08/FFN53/FFN54/FFN56/FFN60/FFN61/FFN63)，但硝酸纤维素膜比较脆，在操作过程中特别是用镊子夹取等过程中容易裂开。膜的使用请参考生产商的推荐使用步骤。

转膜时推荐使用碧云天生产的高品质转印滤纸(7.5×10cm) (FFP51)或Western转膜海绵垫(免滤纸)(FFP55/FFP55FT)。转膜时的溶液推荐使用碧云天的Western转膜液(P0021A/P0021B)、Western快速转膜液(P0572/P0575)、BeyoWB™转膜液(10X) (P0968)、免冰浴Western超快速转膜液(P0573/P0576)或BeyoGel™ Transfer Buffer (for Bis-Tris Gels) (P0753/P0755)。其中优先推荐转膜仅需10 min的BeyoWB™转膜液(10X) (P0968)或免冰浴Western超快速转膜液(P0573/P0576)。如果使用半干转式转膜装置，可使用碧云天生产的Western半干法转膜液(P0021C/P0021D)。

通常如果使用碧云天等品牌的标准湿式转膜装置如MiniBlot™蛋白转膜系统(E6050)，常规转膜液可以设定转膜电流为300-400mA，转膜时间为30-60分钟。也可以在15-20mA转膜过夜。转膜时推荐使用碧云天的MiniProGel™蛋白制胶、电泳与转膜系统(E6150/E6155/E6159)、BeyoPower™ 中电流电源(300V/600mA/100W) (E6080)和BeyoPower™ 高电流电源(300V/2000mA/200W) (E6085)。具体的转膜时间要根据目的蛋白的大小而定，目的蛋白的分子量越大，需要的转膜时间越长，目的蛋白的分子量越小，需要的转膜时间越短。 在转膜过程中，特别是高电流快速转膜时，常规转膜液通常会有非常严重的发热现象，最好把转膜槽放置在冰浴中进行转膜。推荐转膜盒中放入可以有效降低转膜液温度的MiniBlot™蓝冰冰盒(E6069)，有效降低转膜导致的转膜液温度上升。

转膜的效果可以观察所使用的预染蛋白质分子量标准，通常分子量最大的1-2条带较难全部转到膜上。转膜的效果也可以用丽春红染色液(P0022)对膜进行染色，以观察实际的转膜效果。也可以用BeyoBlue™ Plus考马斯亮蓝超快染色液(特快) (P0003)或BeyoBlue™ Plus考马斯亮蓝超快染色液(低背景) (P0004)、考马斯亮蓝快速染色液(P0017)、BeyoBlue™考马斯亮蓝超快染色液(P0017F)对完成转膜的SDS-PAGE凝胶进行快速染色，以观察蛋白的残留情况。

4.封闭(Blocking)

转膜完毕后，立即把蛋白膜放置到预先加入Western洗涤液(P0023C/P0023C3/P0023C6)的Western洗膜盒(FFX050/FFX052/FFX055/FFX056)中，漂洗1-2分钟，以洗去膜上的转膜液。从转膜完毕后所有的步骤，一定要注意膜的保湿，避免膜的干燥，否则极易产生较高的背景。

用BeyoVac™台式真空吸液器(E6878/E6883)或适当移液设备等吸尽洗涤液，优先推荐加入适量的BeyoWB™封闭液(P0950)、QuickBlock™ Western封闭液(P0252)或QuickBlock™无蛋白Western封闭液(P0240/P0242)，在摇床上缓慢摇动，室温封闭5-10分钟；也可以加入Western封闭液(P0023B)，在摇床上缓慢摇动,室温封闭60分钟。对于一些背景较高的抗体，可以适当延长封闭时间，如有必要甚至可以4℃封闭过夜，需要特别注意，QuickBlock™无蛋白Western封闭液(P0240/P0242)的封闭时间不宜超过20分钟。

在整个Western过程中我们推荐使用碧云天的BeyoShaker™数字式翘板摇床(E6673)或类似仪器，侧向摆动速度比较缓慢，而且也容易让溶液覆盖蛋白膜。

封闭液也可以酌情自行使用BSA(ST023)或脱脂奶粉(P0216)进行配制。

碧云天还提供一系列的通用型封闭与抗体稀释液，可实现一种溶液既可以用于膜的封闭，也可用于后续步骤中一抗及二抗的稀释。系列包括通用型封闭与抗体稀释液(P0268)，如果更为注重封闭效果，可以选用QuickBlock™通用型封闭与抗体稀释液(P0269)及QuickBlock™通用型无蛋白封闭与抗体稀释液(P0270)，如果注重信号强度，可选用SignalUp™通用型封闭与抗体稀释液(P0271)，以及对二者较为兼顾的SignalUp™ Plus通用型封闭与抗体稀释液(P0279)。

5.一抗孵育(Primary antibody incubation)

参考一抗的说明书，按照适当比例用BeyoWB™抗体稀释液(P0951)、QuickBlock™ Western一抗稀释液(P0256)、Western一抗稀释液(P0023A)或QuickBlock™无蛋白Western一抗稀释液(P0244)，稀释一抗。同时碧云天提供几千种优质一抗，还有可以直接发光，有效节约实验时间的碧云天HRP标记一抗(AF5006-AF2957)。

用台式真空泵或滴管等吸尽封闭液，立即加入稀释好的一抗，室温或4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时。如果一抗孵育一小时效果不佳，可以4℃缓慢摇动孵育过夜。或根据抗体的说明选择适当的孵育温度和时间。使用碧云天的一些高效抗体稀释液情况，可以参考产品说明书大幅缩短一抗孵育时间。

回收一抗。加入BeyoWB™洗涤液(P0952/P0953)、Western洗涤液(P0023C/P0023C3/P0023C6)，在侧摆摇床上缓慢摇动洗涤5-10分钟。吸尽洗涤液后，再加入洗涤液洗涤5-10分钟。共洗涤3次。如果结果背景较高可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数。使用BeyoWB™洗涤液时，可以参考产品的使用说明，大幅缩短洗涤时间。

注：Western结果通常需要提供内参作为对照，内参抗体选择可参考下表

6. 二抗孵育(Secondary antibody incubation)

参考二抗的说明书，按照适当比例用BeyoWB™抗体稀释液(P0951)、QuickBlock™ Western二抗稀释液(P0258)、Western二抗稀释液(P0023D)或QuickBlock™无蛋白Western二抗稀释液(P0246)稀释辣根过氧化物酶(HRP)或碱性磷酸酶(AP)等标记的二抗。二抗需根据一抗进行选择，例如，一抗是小鼠来源的IgG，则二抗需选择抗小鼠IgG的二抗，如辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG(H+L)(A0216)。碧云天有多种二抗提供。

用BeyoVac™台式真空吸液器(E6878/E6883)或适当移液设备等吸尽洗涤液，立即加入稀释好的二抗，室温或4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育1小时。使用碧云天的一些高效抗体稀释液情况，可以参考产品说明书大幅缩短二抗孵育时间。

回收二抗。加入Western洗涤液(P0023C/P0023C3/P0023C6)，在侧摆摇床上缓慢摇动洗涤5-10分钟。吸尽洗涤液后，再加入洗涤液洗涤5-10分钟。共洗涤3次。如果结果背景较高可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数。使用BeyoWB™洗涤液时，可以参考产品的使用说明，大幅缩短洗涤时间。

7. 蛋白检测(Detection of proteins)

参考相关说明书，使用P0018A)、BeyoECL Moon (P0018F)、BeyoECL SuperMoon (P0018H)或BeyoWB™ BeyoECL (P0955)等ECL类试剂来检测蛋白。压片可以采用专用的压片暗盒(FFC58/FFC83)进行。也可以使用DAB辣根过氧化物酶显色试剂盒(P0202/P0203)、TMB显色液(组化或膜HRP显色用) (P0211)或BCIP/NBT碱性磷酸酯酶显色试剂盒(C3206)。化学发光仪推荐使用碧云天生产的BeyoImager™ 600化学发光成像系统(EI600/EI600C)。

洗片时可以使用X光片自动洗片机。如果没有自动洗片机，可以用显影定影试剂盒(P0019/P0020)自行配制显影液和定影液进行手工洗片。X光片推荐选用原柯达生产的生物实验专用X-OMAT BT胶片(FF058/FF082)。

对于低丰度蛋白样品的检测，推荐使用碧云天BeyoWB™抗体稀释液(P0951)、SignalUp™ Western检测增敏剂(P0272)、SignalUp™ Western一抗稀释液(P0273)、SignalUp™ Western二抗稀释液(P0274)，该系列产品可以增强Western检测时抗原抗体间的特异性结合，从而可以使Western检测的灵敏度增强数倍至十几倍。

8. 膜的重复利用(Membrane recovery)

如果蛋白样品非常宝贵，可以使用Western一抗二抗去除液(P0025/P0025B/P0025N/P0025S)处理蛋白膜，以重复利用蛋白膜。其中最优先推荐Western一抗二抗去除液(中性) (P0025N)，去除效果接近完美，使用更安全。