使用说明：
1.试剂盒的准备工作：
LDH检测工作液(LDH assay working solution)的配制：按照每个检测反应100µl的体积配制适量的LDH检测工作液。均匀混合91μl检测缓冲液(Detection assay buffer)和9μl显色液(Chromogen solution)，即可配制成100µl LDH检测工作液。根据待检测样品(包括对照)的数量，配制适量的LDH检测工作液，具体配制方法参考下表。配制好的LDH检测工作液可以4ºC存放3天，现配现用效果更佳。配制和使用过程中均要注意适当避光。

Samples	1	10	20	50
Detection assay buffer	91μl	910μl	1820μl	4550μl
Chromogen solution	9μl	90μl	180μl	450μl
LDH assay working solution	100μl	1ml	2ml	5ml

2.LDH标准曲线的制作(选做)：
如果希望进行LDH酶活性的绝对定量，需自备LDH标准品(D-LDH、L-LDH或LDH皆可)，并新鲜配制不同浓度LDH标准品，如0、65、125、250、500、1000mU/ml等。如有必要，在后续实验中可以根据样品的LDH活性，对标准曲线的浓度范围进行适当调整。
3.检测细胞数的确定(选做)：
通常按照常规的细胞接种量进行接种即可。但由于每种细胞的LDH量有所差异，为了得到最好的显色效果，可以通过预实验确定最适细胞数。
a.收集细胞，用培养液洗涤细胞后配制成每毫升20万个细胞的细胞悬液，取0、12.5、25、50、100μl细胞悬液接种到96孔细胞培养板中，即每孔细胞数为0、2500、5,000、10,000、20,000个。分两组，一组是总LDH组(Total LDH)、一组是未处理对照组(Untreated control)，每个细胞浓度3个重复，过夜培养。
b.37ºC继续培养一定时间(与正式实验中的药物处理时间一致)。总LDH组各孔加入10μl LDH释放试剂，未处理对照组各孔加入10μl培养液。混匀，室温(约25ºC)避光孵育15分钟。
c.每孔加入100μl LDH检测工作液。混匀，室温(约25ºC)避光孵育0-30分钟，由于不同细胞差异较大，建议首次实验时，分别测定0、5、10、20、30分钟时的吸光度，以便确定最佳反应时间。此时可用铝箔避光包裹后置于水平摇床或侧摆摇床上缓慢摇动。孵育完毕后在450nm处测定吸光度。如无450nm滤光片，可以使用420-480nm的滤光片。可以选择设定600nm(或600nm以上，如650nm)作为参比波长(也称参考波长)。450nm吸光度的读数减去参比波长的吸光度读数即可作为实测读数(A450)。测试总LDH读数不超过但邻近酶标仪吸光度检测上限的细胞密度及孵育时间，即为最适细胞数和最适测试时间。
图2.碧云天乳酸脱氢酶细胞毒性检测试剂盒(WST-8法) (C0018)对A549细胞的检测效果图。使用本试剂盒检测不同细胞数量的A549细胞(含10% FBS培养液)，孵育时间为15分钟。总LDH组吸光度如图所示。实际检测数据会因检测仪器、实验条件等的不同而存在差异，本图仅供参考。
4.细胞毒性样品的准备：
a.按照下表设置各实验组别，将适量细胞接种到96孔板中，过夜培养。按照下表中各组别处理方法更换培养液。注：为确保实验有效性，建议每个组别设置三个复孔。

Groups	Method	Note
未处理对照(Untreated control)	更换100μl的新鲜培养液	含细胞
背景对照(Background control)	更换100μl的新鲜培养液	不含细胞*
总LDH(Total LDH)	更换100μl的新鲜培养液	含细胞
总LDH背景(Background of total LDH)	更换100μl的新鲜培养液	不含细胞*
样品(Sample) **	更换100μl含药培养液***	含细胞
样品背景(Background of Sample)	更换100μl含药培养液***	不含细胞*
阳性对照(Positive Control)(选做，如步骤2)	更换100μl适当稀释后的LDH标准品***

*为了避免培养液中的血清、药物、LDH释放试剂对读数的影响，需设置不含细胞、但加入了相同培养液的组，用于消除背景。
**样品组也可以是仅用于乳酸脱氢酶检测的样品。
***含药培养液：根据实验需要，在新鲜培养液中加入药物(例如加入0-5μl特定的药物)。可设置不同浓度，不同处理时间。
b.到达药物处理的预定时间后，总LDH组和总LDH背景组加入10μl的LDH释放试剂，其它组加入10μl的培养液。混匀，室温(约25ºC)避光孵育15分钟。
5.吸光度测定：
a.如果样品组细胞无其它用途，可以直接在每孔中加入100μl LDH检测工作液。如果样品组细胞还有其它用途，可直接取各孔的上清液100μl，或将培养板用多孔板离心机400×g室温离心5分钟，分别取各孔的上清液100μl。然后加入到一个新的96孔板中，接着加入100μl LDH检测工作液。
b.混匀，室温(约25ºC)避光孵育10-30分钟，孵育的最佳时间可以通过步骤3的预实验确定。孵育时可用铝箔包裹后置于水平摇床或侧摆摇床上缓慢摇动。推荐使用BeyoShaker™数字式翘板摇床(E6673)。
c.在每个孔中加入20μl终止液，混匀，然后在450nm处测定吸光度。如无450nm滤光片，可以使用420-480nm的滤光片。可以选择设定600nm(或600nm以上，如650nm)作为参比波长(也称参考波长)，450nm吸光度的读数扣除参比波长的吸光度读数即可作为实测读数(A450)。
注意：为确保检测效果，可以不添加终止液，在不同时间点测定吸光度，直到获得比较理想的吸光度数据为止，然后再酌情添加终止液。
d.取各组复孔的平均值计算各组别吸光度。
样品组吸光度 = A450样品 - A450样品背景。
总LDH组吸光度 = A450总LDH- A450总LDH背景。
未处理对照组吸光度 = A450未处理对照 - A450空白对照背景。
细胞毒性或死亡率 = (样品组吸光度 – 未处理对照组吸光度) / (总LDH组吸光度 – 未处理对照组吸光度) × 100%
e.可绘制细胞毒性曲线：纵坐标为样品组吸光度，横坐标为药物浓度；据此可计算该药物作用特定时间的半致死剂量LD50。
f.若需准确计算出LDH酶活性的绝对活性，可通过一系列LDH标准品及相应测得的吸光度值绘制标准曲线，通过标准曲线相应公式计算出样品中LDH的酶活性。各孔数值减去背景对照后，以检测的吸光度(OD450)为纵坐标，LDH酶活力(mU)为横坐标，绘制LDH标准曲线，如图3所示。同时计算出该趋势线的公式，这样就可以计算出样品中的LDH酶活力了。
图3.碧云天乳酸脱氢酶细胞毒性检测试剂盒(WST-8法) (C0018)对LDH标准品的检测结果。实际检测数据会因检测仪器、实验条件等的不同而存在差异，本图仅供参考。
A450nm = k × LDH酶活力单位(mU) + b，通过Excel等软件计算出趋势线的斜率k和截距b。
根据上述公式计算样品中LDH活力。
检测体系中样品LDH酶活力单位(mU) = (样品组吸光度 - b) / k
样品中LDH酶活力(mU/ml) = 检测体系中LDH酶活力单位(mU) / 检测样品体积
参考文献：
1.Markert CL. Cell Biochem Funct. 1984. 2(3):131-4.
2.Feng Y, Xiong Y, Qiao T, Li X, Jia L, et al. Cancer Med. 2018. 7(12):6124-6136.
3.Broussas M, Broyer L, Goetsch L. Methods Mol Biol. 2013. 988:305-17.
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