碧云天生物技术-AAV-CAG-GFP (AAV9, 10^13vp/ml)（重组慢病毒）(C4107-250μl)

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AAV-CAG-GFP (AAV9, 10^13vp/ml)

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产品编号	产品名称	产品包装	产品价格
C4107-250μl	AAV-CAG-GFP (AAV9, 10^13vp/ml)	250μl	1268.00元

AAV-CAG-GFP (AAV9)，即AAV9 serotype adeno-associated virus (AAV) expressing GFP，是一种可表达GFP绿色荧光蛋白的腺相关病毒，常用于注射小鼠等动物后作为阴性对照。CAG启动子是一种由巨细胞病毒(CMV)增强子和鸡β-肌动蛋白启动子组合而成的可以用于大多数基因编辑的高效启动子，驱动基因在真核细胞内的高水平表达。CAG启动子保留了CMV增强子，使其具有很强的转录能力，而其中的鸡β-肌动蛋白启动子则使其具有更加广泛和广谱的表达能力。

腺相关病毒是Dependovirus属Parvovirus家族的微小单链DNA病毒，包含100多种血清型。其所介导的基因转移系统可整合至基因组中从而维持外源基因长期稳定表达，广泛用于基因治疗、动物体内目的基因的过表达或敲减等，是一种重要的基因操作工具[1]。AAV感染细胞后通常不会与基因组DNA重组，但可以长期稳定地表达目的蛋白，特别是可以在很多不分裂的细胞中长期稳定表达。AAV还具有滴度高，体内注射不产生明显的免疫反应，对于增殖和非增殖细胞感染效率高等优点。

AAV-CAG-GFP感染后能够在靶细胞中有效表达GFP绿色荧光蛋白，呈现明亮的绿色荧光，可以用作实验对照。

本产品安全性高，由于是复制缺陷型的，感染普通的细胞后不能进行复制和扩增，必须在辅助病毒(如腺病毒和单纯疱疹病毒)存在的情况下才能复制和扩增，从而有效降低了本产品在活体生物中的风险。

腺相关病毒目前发现主要有12种血清型(AAV1-AAV12)，不同血清型AAV有不同的衣壳蛋白，其识别结合的细胞膜表面受体也有所不同，因此不同血清型AAV感染不同类型细胞的感染效率也各不相同。不同血清型AAV的组织亲和性参见下表。

AAV Serotype	Tissue Tropism
AAV Serotype	Liver	Muscle	Brain	Retina	Lung	Heart	Pancreas	Kidney
AAV1		√	Neuron & glia	√		√	√
AAV2	√			√				√
AAV3	√			√		√
AAV4			√			√
AAV5			Neuron & glia	√	alveolar cells
AAV6		√			√	√
AAV7		√	Neuron	√
AAV8	√	√	Neuron	√			√
AAV9	√	√	Neuron	√	√	√	√	√

本产品为组织亲和性最为广泛的AAV9血清型，能感染多种组织，使用相对比较广泛。

不同血清型AAV的感染不同种类体外培养细胞的效率参见下表(以AAV2感染效率100%为标准)。参考下表，本产品感染培养细胞的效率很低，不太适合用于感染培养的细胞。

Cell line	AAV1	AAV2	AAV3	AAV4	AAV5	AAV6	AAV8	AAV9
Huh-7	13	100	2.5	0	0.1	10	0.7	0
HEK293	25	100	2.5	0.1	0.1	5	0.7	0.1
Hela	3	100	2	0.1	6.7	1	0.2	0.1
HepG2	3	100	16.7	0.3	1.7	5	0.3	ND
Hep1A	20	100	0.2	1	0.1	1	0.2	0
911	17	100	11	0.2	0.1	17	0.1	ND
CHO	100	100	14	1.4	333	50	10	1
COS	33	100	33	3.3	5	14	2	0.5
MeWo	10	100	20	0.3	6.7	10	1	0.2
NIH3T3	10	100	2.9	2.9	0.3	10	0.3	ND
A549	14	100	20	ND	0.5	10	0.5	0.1
HT1180	20	100	10	0.1	0.3	33	0.5	0.1
Monocytes	1111	100	ND	ND	125	1429	ND	ND
Immature DC	2500	100	ND	ND	222	2857	ND	ND
Mature DC	2222	100	ND	ND	333	3333	ND	ND

实验室常用的逆转录病毒、慢病毒、腺相关病毒和腺病毒的主要特征之间的比较和差别参见下表。具体的特定病毒的一些特征和下表相比可能会有一定差异。

	Retrovirus	Lentivirus	AAV	Adenovirus
Genome	ssRNA(+)	ssRNA(+)	ssDNA	dsDNA
Coat	Enveloped	Enveloped	Naked	Naked
Particle size	90-100nm	90-100nm	20-30nm	60-90nm
Genome size	7-10kb	9kb	5kb	38-39kb
Genome integration	Yes	Yes	No	No
Packaging capacity	2.5-5kb	2.5-6kb	2.5-4.5kb	3-8kb
Infection tropism	Dividing cells	Dividing and non-dividing cells	Dividing and non-dividing cells	Dividing and non-dividing cells
Relative Transduction Efficiency	ND	70%	70%	100%
Expression started	48-72h	48-72h	72-96h	24-48h
Expression duration	> 2 months	> 2 months	> 6 months	3-4 weeks
Expression level	Medium	Medium	Medium	High
Immune response	Low	Low	Very low	High
In vivo safety	Medium	Medium	High	Low
Titer before concentration (IFU/ml)	10⁶	10⁷	10¹¹	10⁷
Titer after concentration (IFU/ml)	ND	10⁸	0.5-1×10¹³	10¹⁰
Able to obtain high MOI	No (≤ 10 copies integrated)	No (≤ 10 copies integrated)	Yes	Yes
Biosafety level	BSL-2	BSL-2	BSL-1	BSL-2

本产品的滴度为1×10¹³vp/ml。vp, viral particle，即病毒颗粒。如果用于尾静脉注射8-12周的小鼠，每只小鼠的推荐注射量为2-5×10¹¹vp，此时一个包装的本产品可以用于注射5-12只小鼠。用于小鼠脑内(intracerebal)和心室内(intraventricular)注射的推荐用量是1-5×10⁹vp，用于鼻内(intranasal)注射时的推荐用量为1-3×10¹⁰vp，用于眼内(intravitreal)注射时的推荐用量为1-4×10⁹vp。本产品滴度通过Universal AAV Titration Kit by qPCR (C2921)测定。

包装清单：

产品编号	产品名称	包装
C4107-250μl	AAV-CAG-GFP (AAV9, 10^13vp/ml)	250μl
—	说明书	1份

保存条件：

-80ºC保存，一年有效。-20ºC保存，1-2个月内有效。4ºC保存，一周内有效。

注意事项：

反复冻融会降低病毒滴度，如有必要请在收到本产品后分装保存。分装时必须在冰浴上进行。病毒融解后，如果在一周内使用，可以放置于4ºC。如果-80ºC保存时间超过一年，可能会导致滴度下降，此时建议重新测定病毒滴度，建议使用Universal AAV Titration Kit by qPCR (C2921)。

本产品对于小鼠等动物在体内感染的效率很高，但对大多数常见的体外培养细胞的感染效率很低。因此，本产品适合用于小鼠等动物的体内感染，不太适合用于培养细胞的感染。

如果希望使用本产品之外的其它血清型的AAV-CAG-GFP，可以联系碧云天的技术服务部进行定制。

对于一些比较珍贵的基因敲除或转基因动物或者疾病模型动物，建议先注射1-2个野生型正常小鼠进行预实验，确定注射方式和注射剂量后再开始正式实验。

本产品使用前请仔细阅读附录1《腺相关病毒使用安全规范》。本产品生物安全等级为Biosafety Level 1 (BSL-1)，没有确凿证据显示会导致健康成人产生疾病(Not known to consistently cause diseases in healthy adults)，可以按照常规的微生物实验操作要求进行操作(Standard microbiological practices)。

本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。

为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用说明：
1. 根据拟感染的动物组织，选择合适的特定血清型的AAV。AAV9血清型使用最为广泛，可以感染多种小鼠组织，具体请参见本说明书的不同血清型AAV的组织亲和性表。
2. 根据拟感染的动物组织，通过尾静脉注射、局部注射等方式注射本产品。如果用于尾静脉注射8-12周的小鼠，每只小鼠的推荐注射量为2-5×10¹¹vp；用于小鼠脑内(intracerebal)和心室内(intraventricular)注射的推荐用量是1-5×10⁹vp；用于鼻内(intranasal)注射时的推荐用量为1-3×10¹⁰vp；用于眼内(intravitreal)注射时的推荐用量为1-4×10⁹vp。对于特定组织的最佳注射剂量，请参考文献数据或自行通过预实验进行摸索。
3. 通常注射后3-4天即可以检测到GFP绿色荧光蛋白的表达，也可以在注射后更长时间检测GFP绿色荧光蛋白的表达，以确定特定组织中的蛋白表达情况。
参考文献：
1. Potter M, Lins B, Mietzsch M, Heilbronn R, Van Vliet K, et al. Mol Ther Methods Clin Dev. 2014. 1:14034.
附录：
1. 腺相关病毒使用安全规范
a. 作为一种相对安全的病毒，尽管腺相关病毒基因组在感染后通常不会整合进入宿主细胞基因组中，也不会在细胞体内进行复制，但是仍然具有可能的潜在生物学危险。我们建议使用者在病毒操作前应仔细阅读本规范，并在实验中严格按照本规范的要求进行操作。更为严格的美国CDC的生物安全等级及其操作与防护要求参考附表1，也可以访问如下网页：https://www.cdc.gov/labs/pdf/CDC-BiosafetyMicrobiologicalBiomedicalLaboratories-2020-P.pdf。
b. 腺相关病毒操作时应使用相应级别的生物安全柜，不同的腺相关病毒的生物安全等级会有所不同。如果使用普通超净工作台操作病毒，请不要打开排风机，以尽量避免可能污染病毒的尘埃正面吹向操作人员而被吸入。
c. 实验操作时必需佩戴一次性帽子、口罩，穿戴实验手套及专门的实验服，避免身体直接接触病毒。手部及面部有开放性创口时，禁止进行病毒操作。
d. 操作病毒时需小心谨慎，不要产生气雾或飞溅。如果操作时超净工作台或其它器皿上有病毒污染，请立即用70%乙醇或2% SDS溶液擦拭干净，或者采取其它的妥善措施。
e. 如果需要离心，应使用密封性好的离心管，或用封口膜密封后离心，最好使用专门的离心机。
f. 用显微镜观察细胞感染情况时应遵从以下步骤：拧紧培养瓶或盖紧培养板，用70%乙醇清理培养瓶或培养板外壁后到显微镜处观察拍照。离开显微镜实验台之前，用70%乙醇擦洗显微镜实验台。
g. 所有被病毒污染过的枪头、离心管、培养板(皿、瓶)、培养液、手套等，在丢弃前请用84消毒液或2% SDS浸泡过夜。
脱掉手套后，用肥皂或洗手液清洗双手。
h. 病毒飞溅或是含有病毒的气溶胶与人体接触，须用大量清水冲洗眼睛、皮肤或粘膜等接触的部位至少15分钟。
i. 含病毒的针头或是其它利器刺破皮肤，伤口应立即用10%的碘伏溶液擦洗数分钟，然后用大量清水冲洗。
2. 病毒MOI的计算
MOI (Multiplicity of Infection)定义：病毒感染细胞时，病毒数量与细胞数量的比值。
Pfu (Plaque forming units)定义：具有生物活性的病毒颗粒数量。
可以根据如下公式计算所需pfu：
所需pfu=细胞数量×MOI
例如，需要向1×10⁵个细胞中加入2 MOI的病毒，即所需pfu=(1×10⁵ cells)×(2 MOI)=2×10⁵ pfu。若病毒母液滴度为1×10⁸ pfu/ml，则细胞培养液中应加入(2×10⁵ pfu)/(1×10⁸ pfu/ml)=0.002ml病毒母液，即2μl病毒母液。
附表1. 生物安全等级及其操作与防护要求
Table 1. Summary of Recommended Biosafety Levels for Infectious Agents

BSL	Agents	Practices	Primary Barriers and Safety Equipment	Facilities(Secondary Barriers)
1	Not known to consistently cause diseases in healthy adults	Standard microbiological practices	■ No primary barriers required. ■ PPE: laboratory coats and gloves; eye, face protection, as needed	Laboratory bench and sink required
2	■ Agents associated with human disease ■ Routes of transmission include percutaneous injury, ingestion, mucous membrane exposure	BSL-1 practice plus: ■ Limited access ■ Biohazard warning signs ■ " Sharps " precautions ■ Biosafety manual defining any needed waste decontamination or medical surveillance policies	Primary barriers: ■ BSCs or other physical containment devices used for all manipulations of agents that cause splashes or aerosols of infectious materials ■ PPE: Laboratory coats, gloves, face and eye protection, as needed	BSL-1 plus: ■ Autoclave available
3	Indigenous or exotic agents that may cause serious or potentially lethal disease through the inhalation route of exposure	BSL-2 practice plus: ■ Controlled access ■ Decontamination of all waste ■ Decontamination of laboratory clothing before laundering	Primary barriers: ■ BSCs or other physical containment devices used for all open manipulations of agents ■ PPE: Protective laboratory clothing, gloves, face, eye and respiratory protection, as needed	BSL-2 plus: ■ Physical separation from access corridors ■ Self-closing, double-door access ■ Exhausted air not recirculated ■ Negative airflow into laboratory ■ Entry through airlock or anteroom ■ Hand washing sink near laboratory exit
4	■ Dangerous/exotic agents which post high individual risk of aerosol-transmitted laboratory infections that are frequently fatal, for which there are no vaccines or treatments ■ Agents with a close or identical antigenic relationship to an agent requiring BSL-4 until data are available to redesignate the level ■ Related agents with unknown risk of transmission	BSL-3 practices plus: ■ Clothing change before entering ■ Shower on exit ■ All material decontaminated on exit from facility	Primary barriers: ■ All procedures conducted in Class III BSCs or Class I or II BSCs in combination with full-body, air-supplied, positive pressure suit	BSL-3 plus: ■ Separate building or isolated zone ■ Dedicated supply and exhaust, vacuum, and decontamination systems ■ Other requirements outlined in the text

BSL, biosafety level; PPE, personal protective equipment.
相关产品：

产品编号	产品名称	包装
C2902	AAV Purification Kit (All Serotypes)	5 preps
C2921	Universal AAV Titration Kit by qPCR	50次/200次
C3013-250μl	AAV-mCherry-GFP-LC3B (AAV9, 10^13vp/ml)	250μl
C4107-250μl	AAV-CAG-GFP (AAV9, 10^13vp/ml)	250μl
C4108-250μl	AAV-CAG-Cre-GFP (AAV9, 10^13vp/ml)	250μl