使用说明：
1.病毒包装。
推荐使用Lipo8000™转染试剂(C0533)、Lipo6000™转染试剂(C0526)或Lipo293™转染试剂(C0521)包装AAV。用于提取和纯化AAV的包装细胞在转染AAV质粒后，需要使用不含胎牛血清(FBS)的培养基培养3-5天。
2.收集含AAV的细胞沉淀和培养上清液。
完成AAV包装后，将每个175cm2细胞培养瓶或150mm细胞培养皿中的细胞和培养液转移至50ml离心管中，用细胞刮(FSCP023或FSCP029)将培养瓶中的细胞刮下或反复吹打培养液使细胞全部脱落。如果有需要，使用额外的DMEM使总量达到30ml。
注1：建议使用不含胎牛血清(FBS)的DMEM培养基将培养液定容至30ml，以方便后续试剂的等量加入；如不进行定容操作，后续试剂请等比例缩小加入量。
注2：切勿使用反复冻融的病毒液进行纯化，这会严重影响病毒的得率。
注3：包装病毒过程中，建议使用不含血清的培养基，如在包装AAV过程中引入了血清，则需要在纯化的至少前一天更换为不含血清的培养基，因为血清会严重影响病毒纯化效率。
3.每管30ml培养液中加入3ml氯仿，vortex 5分钟以充分混匀。务必确保细胞沉淀完全散开，无可见细胞团块。
最高速度vortex 5分钟或更长时间，悬起沉淀。一定要充分混匀，对着光亮处观察应呈均匀的悬浊液，无明显细胞团块或絮状。
4.每管中加入7.6ml的提取液，vortex 10秒。
最高速度vortex 10秒或更长时间，使溶液充分混匀。
5.将离心管放入预冷离心机，4ºC，3,000×g离心5分钟，将AAV所在的上层水相收集到一个新的50ml离心管中。
注1：离心后，位于离心管底部的白色沉淀可能含有少量残余的氯仿，移动时，不要剧烈晃动离心管以免造成两相混合。
注2：吸取上层水相时，请注意不要吸入氯仿。
6.每管中加入9.4ml沉淀试剂，vortex 10秒，使溶液充分混匀，随后将其在旋转混匀仪或侧摆摇床上继续低转速4ºC孵育混匀至少1小时。
注1：沉淀试剂非常粘稠，需缓慢吸取和加入；且务必确保沉淀试剂和上清液充分混匀，以免影响病毒回收率与纯度。
注2：4ºC充分孵育后，溶液会变浑浊。延长孵育时间(如4ºC过夜)，有助于提高病毒回收率，但孵育时间不宜超过24小时。
注3：请务必在4ºC条件下进行孵育混匀，以确保达到最佳的沉淀效果；孵育温度偏高，会导致沉淀不充分，进而影响病毒纯化效果。混匀仪或侧摆摇床上混匀时，需要确保相应转速下溶液能充分混匀。
7.4ºC，3,000×g离心30分钟，弃上清。
此时离心管管底及侧壁通常可见白色沉淀(有时沉淀不可见)，小心吸除上清，切勿触及沉淀，不要剧烈晃动离心管。
8.4ºC，3,000×g离心1分钟，去除残余上清。
此时白色沉淀会凝聚成一团，小心吸净少量的残留液体，切勿触及沉淀。
9.每管中加入1.4ml重悬液，先用移液器吹打轻悬沉淀，再vortex 5分钟使其充分混匀。
最高速度vortex 5分钟或更长时间，悬起沉淀。一定要充分混匀，对着光亮处观察应呈均匀的悬浊液，无明显团块或絮状。
注：在开始下一步之前，请确保全部沉淀充分悬浮，否则会显著影响回收率。
10.每管中加入29μl Nuclease，混合均匀后，37ºC孵育20-30分钟。
孵育后观察溶液状态，如果十分粘稠，则适当延长孵育时间。
11.将每管重悬液平均分装到两个2ml的离心管中，约700μl/管。
12.按1:1 (v:v)比例加入氯仿，充分vortex 2分钟。
最高速度充分vortex 2分钟，务必充分混匀以使其中的酶完全变性，并至溶液呈乳白色。
13.4ºC，17,000×g离心10分钟。
离心后，底层为氯仿，中间层为白色沉淀，上层水相为病毒液。移动时，注意轻拿轻放，避免剧烈晃动离心管。
14.吸取AAV所在上层水相，并转移至新的离心管中，测量水相体积后，加入推荐量的纯化液A和纯化液B，vortex 2分钟。
纯化液A体积=0.55×水相体积，纯化液B体积=0.52×水相体积。
注1：收集上层水相时，请不要吸到氯仿。
注2：纯化液B非常粘稠，需缓慢吸取，缓慢加入。
15.4ºC，17,000×g离心10分钟。
离心后，底层为含有病毒的透明水相，管底可能有白色沉淀，中间层为薄薄的白色沉淀(有时不可见)，上层呈透明粘稠状。
16.用注射器吸取底部含有病毒的透明水相，转移到新的离心管中。理论上每个15cm培养皿或175cm2瓶在本步骤可获得约1.4ml病毒液。
注：使用注射器针头时，从管壁深入底部，注意避开最底部的白色沉淀(有时不可见)，同时避免吸到上层和中层。
17.超滤管使用前加入500μl无菌水，13,000×g离心1分钟，去除滤液后再加入500μl AAV储存液，4ºC，13,000×g离心1分钟。
注1：本超滤管为双垂直过滤膜，当使用固定角转子时，调整超滤管，使刻度印刷面在两侧(即滤膜面板在两侧)，使用水平转子时没有此要求。请勿省略本步骤的任何一次加入液体进行洗涤的步骤，否则会影响后续的超滤效果。
注2：加入无菌水离心后请注意检查是否有约5μl死体积的液体留存。如果没有相应体积的液体残留，提示超滤管膜发生破损，不能继续使用。
注3：无菌水推荐选购BeyoPure™ Ultrapure Water (DNase/RNase-Free, Sterile) (ST876)。
18.去除滤液后，在超滤管中加入样品(每次加入量不能超过500μl)，4ºC，13,000×g离心3分钟。重复操作，直至全部样品完成超滤。
离心后请确认滤杯中未滤过的AAV溶液少于50μl，否则须延长离心时间。
19.去除滤液后，加入400μl AAV储存液至滤杯中，吹打混匀，4ºC，13,000×g离心3分钟。
离心后请确认滤杯中AAV溶液少于50μl，否则须延长离心时间。
20.重复上一步4次(总计5次)，最终离心浓缩到合适的体积。
本试剂盒提供的超滤管有适用于移液器回收的独特死体积收集器，因此至少可保留约5μl病毒液，可以根据实际需要将病毒浓缩到合适的体积。
21.去除滤液后，使用移液器吹打死体积收集器中的液体使病毒充分悬浮，吸取重悬的AAV液体，适当分装后-80ºC保存。
为避免AAV病毒反复冻融而部分失活，可根据后续实验的需要，适当分装后于-80ºC保存。如需进一步确保纯化后的AAV病毒是无菌的，可以在后续使用的时候适当稀释后进行过滤除菌。体积过小时进行过滤除菌，可能会导致在滤膜上残留较大量的AAV。
常见问题：
1.AAV有哪些优点？
AAV感染细胞后通常不会与基因组DNA重组，但可以长期稳定地表达目的蛋白，特别是可以在很多不分裂的细胞中长期稳定表达。AAV还具有滴度高，体内注射不产生明显的免疫反应，对于增殖和非增殖细胞感染效率高等优点。
2.AAV有哪些常见血清型？如何选择血清型？
AAV目前发现主要有12种血清型(AAV1-AAV12)，不同血清型AAV有不同的衣壳蛋白，其识别结合的细胞膜表面受体也有所不同，因此不同血清型AAV感染不同类型细胞的感染效率也各不相同。不同血清型AAV的组织亲和性参见下表。

AAV Serotype	Tissue Tropism
	Liver	Muscle	Brain	Retina	Lung	Heart	Pancreas	Kidney
AAV1		√	Neuron & glia	√		√	√
AAV2	√			√				√
AAV3	√			√		√
AAV4			√			√
AAV5			Neuron & glia	√	alveolar cells
AAV6		√			√	√
AAV7		√	Neuron	√
AAV8	√	√	Neuron	√			√
AAV9	√	√	Neuron	√	√	√	√	√

3.AAV可以用于感染体外培养细胞吗？
不同血清型AAV的感染不同种类体外培养细胞的效率参见下表(以AAV2感染效率100%为标准)。

Cell line	AAV1	AAV2	AAV3	AAV4	AAV5	AAV6	AAV8	AAV9
Huh-7	13	100	2.5	0	0.1	10	0.7	0
HEK293	25	100	2.5	0.1	0.1	5	0.7	0.1
Hela	3	100	2	0.1	6.7	1	0.2	0.1
HepG2	3	100	16.7	0.3	1.7	5	0.3	ND
Hep1A	20	100	0.2	1	0.1	1	0.2	0
911	17	100	11	0.2	0.1	17	0.1	ND
CHO	100	100	14	1.4	333	50	10	1
COS	33	100	33	3.3	5	14	2	0.5
MeWo	10	100	20	0.3	6.7	10	1	0.2
NIH3T3	10	100	2.9	2.9	0.3	10	0.3	ND
A549	14	100	20	ND	0.5	10	0.5	0.1
HT1180	20	100	10	0.1	0.3	33	0.5	0.1
Monocytes	1111	100	ND	ND	125	1429	ND	ND
Immature DC	2500	100	ND	ND	222	2857	ND	ND
Mature DC	2222	100	ND	ND	333	3333	ND	ND

4.为什么纯化后病毒得率较低？
a.切勿使用经过反复冻融后的病毒液进行纯化，这会严重影响病毒的得率。
b.包装后过早收集病毒，病毒产量较低。建议包装后3-5天进行病毒收集。
c.病毒总体积小于或等于30ml时，请使用0.5ml的超滤管；病毒总体积为90-120ml时，请使用15ml的超滤管，以减少吸附损失。
5.为什么纯化后病毒纯度较低？
a.本产品的纯化对象中禁止含有血清，建议包装病毒时使用不含血清的培养基，或至少在纯化前一天更换为无血清培养基或OptiPRO™ SFM。如果培养液中含有血清，则在纯化时应去除上清，但会导致病毒得率下降。
b.细胞沉淀和培养上清液使用量过多，导致纯化不完全。请按照说明书推荐用量进行纯化。
参考文献：
1.Potter M, Lins B, Mietzsch M, Heilbronn R, Van Vliet K, et al. Mol Ther Methods Clin Dev. 2014. 1:14034.
2.Zolotukhin S, Byrne BJ, Mason E, Zolotukhin I, Potter M, et al. Gene Ther. 1999. 6(6):973-85.
3.Ayuso E, Mingozzi F, Montane J, Leon X, Anguela XM, et al. Gene Ther. 2010. 7(4):503-10.
附录：
1.腺相关病毒使用安全规范：
a.作为一种相对安全的病毒，尽管腺相关病毒(AAV)基因组在感染后通常不会整合进入宿主细胞基因组中，也不会在细胞体内进行复制，但是仍然具有可能的潜在生物学危险。我们建议使用者在病毒操作前应仔细阅读本规范，并在实验中严格按照本规范的要求进行操作。更为严格的美国CDC的生物安全等级及其操作与防护要求参考附表1，也可以访问如下网页：https://www.cdc.gov/labs/pdf/CDC-BiosafetyMicrobiologicalBiomedicalLaboratories-2020-P.pdf。
b.AAV操作时应使用相应级别的生物安全柜，不同的AAV的生物安全等级会有所不同。如果使用普通超净工作台操作病毒，请不要打开排风机，以尽量避免可能污染病毒的尘埃正面吹向操作人员而被吸入。
c.实验操作时必需佩戴一次性帽子、口罩，穿戴实验手套及专门的实验服，避免身体直接接触病毒。手部及面部有开放性创口时，禁止进行病毒操作。
d.操作病毒时需小心谨慎，不要产生气雾或飞溅。如果操作时超净工作台或其它器皿上有病毒污染，请立即用70%乙醇或2% SDS溶液擦拭干净，或者采取其它的妥善措施。
e.如果需要离心，应使用密封性好的离心管，或用封口膜密封后离心，最好使用专门的离心机。
f.用显微镜观察细胞感染情况时应遵从以下步骤：拧紧培养瓶或盖紧培养板，用70%乙醇清理培养瓶或培养板外壁后到显微镜处观察拍照。离开显微镜实验台之前，用70%乙醇擦洗显微镜实验台。
g.所有被病毒污染过的枪头、离心管、培养板(皿、瓶)、培养液、手套等，在丢弃前请用84消毒液或2% SDS浸泡过夜。脱掉手套后，用肥皂或洗手液清洗双手。
h.病毒飞溅或是含有病毒的气溶胶与人体接触，须用大量清水冲洗眼睛、皮肤或粘膜等接触的部位至少15分钟。
i.含病毒的针头或是其它利器刺破皮肤，伤口应立即用10%的碘伏溶液擦洗数分钟，然后用大量清水冲洗。
附表1. 生物安全等级及其操作与防护要求
Table 1. Summary of Recommended Biosafety Levels for Infectious Agents

BSL	Agents	Practices	Primary Barriers and Safety Equipment	Facilities(Secondary Barriers)
1	Not known to consistently cause diseases in healthy adults	Standard microbiological practices	■ No primary barriers required. ■ PPE: laboratory coats and gloves; eye, face protection, as needed	Laboratory bench and sink required
2	■ Agents associated with human disease ■ Routes of transmission include percutaneous injury, ingestion, mucous membrane exposure	BSL-1 practice plus: ■ Limited access ■ Biohazard warning signs ■ “Sharps” precautions ■ Biosafety manual defining any needed waste decontamination or medical surveillance policies	Primary barriers: ■ BSCs or other physical containment devices used for all manipulations of agents that cause splashes or aerosols of infectious materials ■ PPE: Laboratory coats, gloves, face and eye protection, as needed	BSL-1 plus: ■ Autoclave available
3	Indigenous or exotic agents that may cause serious or potentially lethal disease through the inhalation route of exposure	BSL-2 practice plus: ■ Controlled access ■ Decontamination of all waste ■ Decontamination of laboratory clothing before laundering	Primary barriers: ■ BSCs or other physical containment devices used for all open manipulations of agents ■ PPE: Protective laboratory clothing, gloves, face, eye and respiratory protection, as needed	BSL-2 plus: ■ Physical separation from access corridors ■ Self-closing, double-door access ■ Exhausted air not recirculated ■ Negative airflow into laboratory ■ Entry through airlock or anteroom ■ Hand washing sink near laboratory exit
4	■ Dangerous/exotic agents which post high individual risk of aerosol-transmitted laboratory infections that are frequently fatal, for which there are no vaccines or treatments ■ Agents with a close or identical antigenic relationship to an agent requiring BSL-4 until data are available to redesignate the level ■ Related agents with unknown risk of transmission	BSL-3 practices plus: ■ Clothing change before entering ■ Shower on exit ■ All material decontaminated on exit from facility	Primary barriers: ■ All procedures conducted in Class III BSCs or Class I or II BSCs in combination with full-body, air-supplied, positive pressure suit	BSL-3 plus: ■ Separate building or isolated zone ■ Dedicated supply and exhaust, vacuum, and decontamination systems ■ Other requirements outlined in the text

BSL, biosafety level; PPE, personal protective equipment.
相关产品：

产品编号	产品名称	包装
C2901	通用型病毒浓缩试剂盒	150ml/600ml/3L
C2906	AAV Purification Kit Mini for All Serotypes	5次/20次
C2908	AAV Purification Kit Midi for All Serotypes	5次/20次
C3013	AAV-mCherry-GFP-LC3B (AAV9, 10^13vp/ml)	250μl
C4107	AAV-CAG-GFP (AAV9, 10^13vp/ml)	250μl
C4108	AAV-CAG-Cre-GFP (AAV9, 10^13vp/ml)	250μl
FCD150	BeyoGold™ 150mm细胞培养皿	5个/袋，12袋/箱
FFLK176	BeyoGold™ 175cm2透气盖细胞培养瓶	5个/包，40个/箱
FSCP023	BeyoGold™ 23cm细胞刮(独立纸塑包装, 无菌)	100个/盒
FSCP029	BeyoGold™ 29cm细胞刮(独立纸塑包装, 无菌)	100个/盒
C3013	AAV-mCherry-GFP-LC3B (AAV9, 10^13vp/ml)	250μl
FUF058	超滤管(0.5ml, 100kDa MWCO, PES, Sartorius分装)	5个/25个/100个
FUF158	超滤管(15ml, 100kDa MWCO, PES, Sartorius分装)	2个/12个/48个
ST876	BeyoPure™ Ultrapure Water (DNase/RNase-Free, Sterile)	100ml/500ml