碧云天的线粒体超氧化物检测试剂盒(MitoNeoD) (Mitochondrial Superoxide Assay Kit with MitoNeoD)是一种以MitoNeoD为荧光探针，快速灵敏地检测线粒体内超氧化物变化的试剂盒。本试剂盒可使用荧光显微镜、激光共聚焦显微镜、荧光酶标仪、流式细胞仪等荧光检测系统进行检测。与基于MitoSO™ Red (也称MitoSox Red)的线粒体超氧化物检测试剂盒(如S0061)相比，MitoNeoD染色定位更精准，仅线粒体呈现荧光强度变化，而使用MitoSO™ Red的情况下，线粒体和细胞核的荧光都会发生变化。

超氧化物通常指超氧化物阴离子(Superoxide anion) O2·-，是一种氧分子的自由基。在呼吸链中，NADPH氧化酶把电子传递给氧分子的时候，就会产生超氧化物阴离子O2·-。超氧化物阴离子O2·-是一种强氧化剂，可以由被刺激的白细胞等产生，从而抵御微生物的感染等。超氧化物阴离子O2·-也可以导致氧化损伤，和许多疾病的发生密切相关[1-3]。

MitoNeoD，也称MND、Mito-NeoD、Mito Neo D、Mito Neo-D，CAS号为2375088-89-2，分子量为853.99，分子式为C53H62DBrN3P，是一种可快速、特异性地靶向线粒体，从而选择性地检测线粒体内的超氧化物的新型荧光探针。MitoNeoD由三部分组成：对O2·-敏感的还原菲啶核心部分，该部分经过修饰可防止DNA嵌入；碳-氘键(C-D)，该部分通过动力学同位素效应(Kinetic isotope effect, KIE)以提高其对O2·-的选择性，从而增强其对超氧化物的选择性；三苯基鏻亲脂性阳离子部分，该部分通过线粒体膜电位驱动探针在线粒体基质富集。与MitoSO™ Red (也称MitoSox Red)相比，MitoNeoD具有对线粒体靶向定位更精准、荧光信号更稳定的特点。MitoNeoD与超氧化物反应后不会重新分布，因此仅线粒体中的红色荧光显著增强[4-7]。

本试剂盒检测线粒体内超氧化物的原理如图1所示。MitoNeoD的三苯基鏻亲脂性阳离子部分，促使其进入活细胞并选择性地靶向进入线粒体，MitoNeoD在线粒体内被超氧化物氧化为MitoNeoOH，并产生强烈的红色荧光，MitoNeoOH激发波长为544nm，发射波长为605nm。

图1.碧云天线粒体超氧化物检测试剂盒(MitoNeoD) (S0062)检测原理图。

本试剂盒提供的MitoNeoD为10mM储存液。本试剂盒推荐的最终使用浓度经过优化，对大多数细胞都适用，但为了得到更满意的结果，对于不同类型的细胞请自行进行一定摸索，MitoNeoD的终浓度通常为5-10μM，最优先的推荐终浓度为10μM。同时，本试剂盒提供的mSoxUp作为诱导细胞线粒体内超氧化物生成的阳性对照，终浓度通常为0.5-2X，最优先的推荐终浓度为1X。使用本试剂盒检测细胞线粒体内超氧化物的效果参考图2和图3。

图2.碧云天线粒体超氧化物检测试剂盒(MitoNeoD) (S0062)检测L929细胞(小鼠成纤维细胞)线粒体内超氧化物的荧光显微镜效果图。L929细胞不处理或用阳性对照试剂mSoxUp处理后，使用本试剂盒和Hoechst 33342以及Mito-Tracker Green进行染色。正常的L929细胞中未氧化MitoNeoD，细胞中红色荧光非常弱，几乎观察不到红色荧光；使用诱导线粒体内超氧化物生成的阳性对照试剂mSoxUp处理后，线粒体内超氧化物生成增加，MitoNeoD与超氧化物反应，并在线粒体基质富集，细胞中线粒体的红色荧光显著增强。蓝色荧光为Hoechst 33342标记的所有细胞的细胞核。绿色荧光为Mito-Tracker Green标记的所有细胞的线粒体。本试剂盒中不提供Hoechst 33342和Mito-Tracker Green，如有需要，可向碧云天订购Hoechst 33342染色液(C1022-C1029)、Mito-Tracker Green (线粒体绿色荧光探针) (C1048)。实际检测效果会因实验条件、检测仪器等的不同而存在差异，图中效果仅供参考。

图3.碧云天线粒体超氧化物检测试剂盒(MitoNeoD) (S0062)检测L929细胞(小鼠成纤维细胞)线粒体内超氧化物的流式细胞术效果图。L929细胞不处理或用阳性对照试剂mSoxUp处理后，使用本试剂盒进行染色并进行流式细胞术检测。正常的L929细胞中未氧化MitoNeoD，细胞中红色荧光非常弱；使用诱导线粒体内超氧化物生成的阳性对照试剂mSoxUp处理后，线粒体内超氧化物生成增加，细胞中的红色荧光显著增强。流式检测荧光通道为PE-Texas Red (Ex/Em=561/610)。实际检测效果会因实验条件、检测仪器等的不同而存在差异，图中效果仅供参考。

本试剂盒小包装和中包装，MitoNeoD (10mM)按照1:1000的比例稀释，6孔板每孔检测体系为1ml时，可以分别进行20和100次检测；96孔板每孔检测体系为100μl时，可以分别检测200和1000次。

-20ºC保存，一年有效。MitoNeoD (10mM)须避光保存，-80ºC保存效果更好。

BSA和酚红(Phenol red)对本荧光探针的检测有干扰，需避免。

对于特定细胞的检测，建议先进行预实验，以确定适当的荧光探针浓度和孵育时间。

MitoNeoD在激光照射下容易发生淬灭，因此需要在保证荧光亮度的前提下尽可能降低染料使用浓度，降低荧光显微镜激发光强度，缩短拍照时间。

本试剂盒仅限于进行存活的细胞或组织的检测，不可用于固定或冻存的细胞或组织样品的检测。

荧光酶标仪检测时须使用适合荧光检测的黑板或白板，推荐使用碧云天BeyoGold™全黑96孔细胞培养板(平底带盖, 独立包装) (FCP966)或BeyoGold™黑色透明底96孔细胞培养板(平底带盖, 独立包装) (FCP965)。

第一次使用时请分装成小包装后-20ºC保存，以避免反复冻融。

本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。

为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。