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| 产品编号 | 产品名称 | 产品包装 | 产品价格 |
| D2524-1μg | Pgrac100-amyQ-N-His-WELQ-Cm | 1μg | 888.00元 |
| D2524-100μg | Pgrac100-amyQ-N-His-WELQ-Cm | 100μg | 1169.00元 |
Pgrac100-amyQ-N-His-WELQ-Cm是碧云天自行研发的一种用于枯草芽孢杆菌分泌表达N端含有His标签(His tag)和WELQ蛋白酶酶切位点的目的蛋白的原核表达质粒。该质粒为大肠杆菌/枯草芽孢杆菌穿梭质粒，可在大肠杆菌中进行载体构建和扩增并在枯草芽孢杆菌中进行高水平外源蛋白表达。
本质粒含有Pgrac100强启动子和Lac操纵子，可以在异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)的诱导下高效启动目的基因表达[1, 2]。多克隆位点5'端含有淀粉酶amyQ信号肽，可以将目的蛋白分泌到枯草芽孢杆菌胞外的培养基中。信号肽后面连接的His标签紧接着连接12bp的碱基，翻译出W-E-L-Q四个氨基酸，可以被WELQ Protease (P2311)识别并在Q残基位点后进行切割。在多克隆位点内按照读码框的方向插入带有终止密码子的目的基因，就可以表达N端带有His标签和WELQ蛋白酶酶切位点的目的蛋白。
WELQ蛋白酶能特异性地识别四肽序列Trp-Glu-Leu-Gln (W-E-L-Q)，并对Gln (Q)之后的肽键进行酶切，常用于重组蛋白除去His或者其它融合标签，其最突出优势是酶切后不会在目的蛋白的N端留下任何额外的氨基酸残基。枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是工业应用中一种重要的模式菌株，具有内毒素低、非致病性、遗传背景清晰、分泌蛋白能力强、容易分离培养等特性，是异源蛋白表达和分泌的理想宿主。由于从枯草芽孢杆菌中提取质粒和构建质粒较为困难，而在大肠杆菌中操作则更为简单方便，所以可通过构建大肠杆菌/枯草芽孢杆菌穿梭载体，先将外源目的基因在大肠杆菌中构建完成后再转入枯草芽孢杆菌中进行外源蛋白表达[3]。
Pgrac100-amyQ-N-His-WELQ-Cm能表达α-淀粉酶amyQ的信号肽(氨基酸序列为：MIQKRKRTVSFRLVLMCTLLFVSLPITKASA)，可用于引导目的蛋白的分泌表达。蛋白前体在核糖体合成过程中或合成后被信号肽识别颗粒(SRP)或分子伴侣识别并通过Sec分泌途径实现跨膜，蛋白在输出到外膜时，I型信号肽酶(SPase I)会识别amyQ信号肽的保守序列，即A-X(任意氨基酸)-A，并且在最后一个A(丙氨酸)后面产生酶切，释放成熟蛋白，之后在折叠因子和分子伴侣作用下折叠成正确的蛋白构象[4, 5]。因此，如果将目的蛋白通过无缝克隆的方式克隆在紧邻amyQ信号肽序列之后，目的蛋白的N端不会残留任何多余氨基酸残基。
本质粒为氨苄青霉素(Ampicillin)和氯霉素(Chloramphenicol)双抗性，在大肠杆菌中进行质粒扩增时，推荐氨苄青霉素筛选浓度为100μg/ml，在枯草芽孢杆菌中进行蛋白表达时，推荐氯霉素筛选浓度为5μg/ml [6]。
本质粒适用于转化枯草芽孢杆菌168∆4菌株(D0441)，在转化枯草芽孢杆菌感受态细胞时，建议做一组不转化质粒的阴性对照，防止出现抗生素浓度低，对宿主无效的情况。根据阴性对照实际情况，再适当调整抗生素的使用浓度。枯草芽孢杆菌转化推荐使用碧云天枯草芽孢杆菌感受态制备试剂盒(D0312)。
Pgrac100-amyQ-N-His-WELQ-Cm质粒(8064bp)的图谱如下：
Pgrac100-amyQ-N-His-WELQ-Cm质粒的主要信息如下：
| Feature Nucleotide | Position |
| Chloramphenicol resistance ORF (Cm) | 113-763 |
| lacI | 1298-2380 |
| Pgrac100 | 2632-2748 |
| Lac operator | 2709-2733 |
| Ribosome-binding site (RBS) | 2739-2746 |
| amyQ (signal peptide of α-amylase) | 2755-2847 |
| 8X His | 2860-2883 |
| WELQut site | 2884-2895 |
| Multiple cloning sites (MCS) | 2896-2924 |
| Terminator | 2941-2966 |
| repA | 3167-4200 |
| AmpR promoter | 6141-6245 |
| AmpR resistance ORF | 6246-7106 |
| ori | 7277-7865 |
Pgrac100-amyQ-N-His-WELQ-Cm的多克隆位点的详细图谱如下：https://www.beyotime.com/Manual/D2524 Pgrac100-amyQ-N-His-WELQ-Cm.pdf。
Pgrac100-amyQ-N-His-WELQ-Cm中没有的酶切位点包括：
| AarI | AbsI | AccIII | Acc36I | AccB7I | AcvI | AdeI |
| AfeI | AgeI | AleI | AloI | Aor13HI | Aor51HI | AscI |
| AsiGI | AsiSI | AspI | AspA2I | AvrII | AxyI | BaeI |
| BalI | BarI | BbrPI | BbvCI | BfuAI | BlnI | BlpI |
| BoxI | Bpu1102I | BsaMI | Bse21I | BseAI | BshTI | BsmI |
| Bsp13I | Bsp68I | Bsp1407I | Bsp1720I | BspEI | BspMI | BsrGI |
| BssNAI | Bst1107I | BstAUI | BstENI | BstPAI | BstZ17I | Bsu36I |
| BtuMI | BveI | CelII | Cfr42I | CpoI | CspI | CspAI |
| DraII | DraIII | Eco47III | Eco72I | Eco81I | EcoNI | EcoO109I |
| FseI | FspAI | I-CeuI | I-PpoI | I-SceI | KflI | Kpn2I |
| KspI | MauBI | MlsI | MluNI | MreI | MroI | MroNI |
| MscI | Msp20I | MssI | Mva1269I | NaeI | NgoMIV | NruI |
| OliI | PacI | PalAI | PasI | PctI | PdiI | PflFI |
| PflMI | PfoI | PI-PspI | PI-SceI | PinAI | PmaCI | PmeI |
| PmlI | PpuMI | PshAI | Psp5II | PspCI | PspPPI | PspXI |
| PsrI | PsyI | RgaI | RigI | RruI | RsrII | Rsr2I |
| SacII | SanDI | SbfI | SdaI | SfaAI | SfiI | Sfr303I |
| SgfI | SgrAI | SgrBI | SgrDI | SgsI | SrfI | Sse8387I |
| SspBI | SstII | Tth111I | Van91I | XagI | XmaJI |
Pgrac100-amyQ-N-His-WELQ-Cm中的单酶切位点包括：
| AatII | Acc65I | AflII | AhdI | ApaI | BamHI | BmgBI |
| BmtI | Bpu10I | BsaI | BsaBI | BseRI | BsiWI | BspDI |
| BssHII | BstEII | ClaI | DrdI | EagI | Eco53kI | EcoRV |
| HpaI | KasI | KpnI | MfeI | NarI | NheI | NotI |
| PaeR7I | PluTI | PspOMI | PstI | SacI | SexAI | SfoI |
| SmaI | SnaBI | SpeI | SphI | TspMI | XbaI | XhoI |
| XmaI | ZraI |
Pgrac100-amyQ-N-His-WELQ-Cm质粒中推荐使用的测序引物序列如下：
Forward primer (2598-2617):5'-GACCTCGTTTCCACCGGAAT-3'
Reverse primer (3201-3220): 5'-TCTTCTTCCGTGATTCCTTG-3'
Pgrac100-amyQ-N-His-WELQ-Cm的全序列信息：D2524 Pgrac100-amyQ-N-His-WELQ-Cm全序列.txt
包装清单：| 产品编号 | 产品名称 | 包装 |
| D2524-1µg | Pgrac100-amyQ-N-His-WELQ-Cm | 1µg |
| D2524-100µg | Pgrac100-amyQ-N-His-WELQ-Cm | 100µg |
| — | 说明书 | 1份 |
-20ºC保存。
注意事项：本质粒未经碧云天书面许可不得用于任何商业用途，也不得移交给订货人所在实验室外的任何个人或单位。
本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。
为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
| 产品编号 | 产品名称 | 包装 |
| D0312 | 枯草芽孢杆菌感受态制备试剂盒 | 20次/100次 |
| D0441 | 枯草芽孢杆菌168∆4甘油菌 | 200μl |
| D0442 | 枯草芽孢杆菌WB800甘油菌 | 200μl |
| D2521 | Pgrac100-C-His-Cm | 1µg/100µg |
| D2522 | Pgrac100-amyQ-C-His-Cm | 1µg/100µg |
| D2523 | Pgrac100-N-His-WELQ-Cm | 1µg/100µg |
| D2524 | Pgrac100-amyQ-N-His-WELQ-Cm | 1µg/100µg |
| D2525 | Pgrac100-C-His-Tet | 1µg/100µg |
| D2526 | Pgrac100-amyQ-C-His-Tet | 1µg/100µg |
| ST1150 | 氯霉素(≥98%, Reagent grade) | 5g/25g/100g |
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