使用说明：
1.溶液配制。
a.SA-Green染色工作液的用量。对于6、12、24、96孔板，每孔的SA-Green染色工作液分别为1ml、0.5ml、500μl和100μl；对于流式细胞样品，每个样品的SA-Green染色工作液为0.5ml；对于切片，可以根据切片大小，每个切片使用50μl的SA-Green染色工作液。
b.SA-Green染色工作液(SA-Green Staining Solution)的配制。
按照96孔板每孔100μl SA-Green染色工作液的体系，参考下表配制适量的SA-Green染色工作液，充分混匀。
(a)对于活细胞染色：配制SA-Green染色工作液A。
根据样品数量和每个样品所需工作液的体积，计算出SA-Green染色工作液A的总体积。取一定量SA-Green (1000X)和Endogenous β-gal Inhibitor (1000X)分别按照1:1000的比例加入到完全培养液或HBSS (C0218/C0219)、PBS (C0221B)等合适的溶液中，使最终浓度为1X。例如取1µl SA-Green (1000X)和1µl Endogenous β-gal Inhibitor (1000X)加入到1ml完全培养液中，混匀后即为1ml SA-Green染色工作液A。如果需要染色细胞核，可以同时将Hoechst 33342 (C1027/C1028/C1029)等适当的细胞核染色液按一定比例加入SA-Green染色工作液A中。

Reagent	1 Sample	10 Samples	100 Samples
SA-Green (1000X)	0.1μl	1μl	10μl
Endogenous β-gal Inhibitor (1000X)	0.1μl	1μl	10μl
Culture medium	100μl	1ml	10ml
SA-Green Staining Solution A	~100μl	~1ml	~10ml

(b)对于固定细胞或冰冻切片样品的染色：配制SA-Green染色工作液B。
根据样品数量和每个样品所需工作液的体积，计算出SA-Green染色工作液B的总体积。取一定量SA-Green (1000X)按照1:1000的比例加入到Assay Buffer中，使最终浓度为1X。例如取1µl SA-Green (1000X)加入到1ml Assay Buffer中，混匀后即为1ml SA-Green染色工作液B。

Reagent	1 Sample	10 Samples	100 Samples
SA-Green (1000X)	0.1μl	1μl	10μl
Assay Buffer	100μl	1ml	10ml
SA-Green Staining Solution B	~100μl	~1ml	~10ml

注1：SA-Green染色工作液A或者B须现配现用。
注2：染色工作液中SA-Green的最终浓度需根据不同细胞和冰冻切片实验体系通过预实验进行优化。SA-Green的推荐工作浓度为1X，可以在0.2-4X范围内摸索最佳工作浓度，通常组织冰冻切片样品的工作浓度可能需要适当提高。但为降低非特异性荧光染色，在染色效果可以接受的范围内，建议尽量使用较低浓度的SA-Green。
注3：衰老细胞中可能会积累一些具有自发荧光的不溶性物质，从而导致更高的荧光背景，建议同时设置一组无SA-Green染色工作液的空白对照。
注4：Endogenous β-gal Inhibitor的终浓度通常为0.5-2X，最优先的推荐终浓度为1X。
c.Endogenous β-gal Inhibitor工作液的配制：取一定Endogenous β-gal Inhibitor (1000X)按照1:1000的比例加入到完全培养液中，使最终浓度为1X。例如取1µl Endogenous β-gal Inhibitor (1000X)加入到1ml完全培养液中，混匀后即为1ml Endogenous β-gal Inhibitor工作液。
注：Endogenous β-gal Inhibitor的终浓度通常为0.5-2X，最优先的推荐终浓度为1X。
2.活细胞衰老阳性对照的设置(选做)。如下方法实测对于L929和Hela细胞有效，其余细胞请自行尝试和摸索。
a.1X SAup溶液的配制。取一定SAup (1000X)按照1:1000的比例加入到无血清培养液中，使最终浓度为1X。例如取1µl SAup (1000X)加入到1ml无血清培养液中，混匀后即为1ml 1X SAup溶液。
b.每孔加入一定量1X SAup溶液，置于细胞培养箱中培养3天。
c.除去上清液，PBS洗涤细胞1次。
d.加入完全培养液，置于细胞培养箱中继续培养3天，随后可进行检测。
注1：SAup的终浓度通常为0.5-2X，最优先的推荐终浓度为1X。对于特定的细胞，SAup作用浓度和作用时间可能有所不同，需自行摸索最佳工作浓度和作用时间，甚至某些细胞可能对SAup不敏感。
注2：阳性对照(SAup)仅用于作为阳性对照的样品，并不是在每个样品中都需加入阳性对照(SAup)。
3.贴壁活细胞染色。
a.将贴壁细胞种于细胞培养皿、多孔细胞培养板或者细胞爬片上。
b.吸除细胞培养液，用HBSS或PBS洗涤细胞1次。
c.加入适当体积的Endogenous β-gal Inhibitor工作液。
d.37ºC孵育细胞1小时。
e.吸除Endogenous β-gal Inhibitor工作液，用HBSS或PBS洗涤细胞1次。
f.缓慢加入适当体积的步骤1b (a)配制的SA-Green染色工作液A，轻轻晃动使染料均匀覆盖所有细胞。
g.37ºC避光孵育细胞0.5-1小时，不同的细胞最佳培养时间不同。以0.5小时作为初始孵育时间，根据实际所用的细胞优化染色时间，以得到最佳的荧光染色效果。
h.吸除SA-Green染色工作液A，用HBSS或PBS洗涤2-3次，然后加入HBSS、PBS或细胞培养液即可在荧光显微镜下观察，或使用荧光酶标仪检测。
注1：如果使用流式细胞仪检测，可以消化收集细胞，PBS重悬后进行检测。
注2：如果细胞贴壁不太好，各溶液加入时请沿着孔板壁缓慢加入，然后轻轻晃动培养器皿，以避免细胞被冲散。
注3：荧光酶标仪检测时需要考虑到检测时的细胞数量。如果接种后需要培养一段时间或药物处理时间比较长，则需要适当降低接种细胞数量。细胞数量过多或过少，都可能会影响荧光酶标仪的检测效果，其它相关条件也可能需要进行一些优化。
4.悬浮活细胞染色。
a.加入适当体积的Endogenous β-gal Inhibitor工作液重悬细胞，使其密度为100-2000万/ml左右。
b.37ºC孵育细胞1小时。
c.600×g 4ºC离心3-4分钟。
d.吸除上清液，缓慢加入适当体积的SA-Green染色工作液A (步骤1b (a))重悬细胞。
e.37ºC避光孵育细胞0.5-1小时。不同的细胞最佳孵育时间不同。以0.5小时作为初始孵育时间，根据实际所用的细胞优化染色时间，以得到最佳的荧光染色效果。
f.600×g 4ºC离心3-4分钟。
g.吸除上清液，缓慢加入适量PBS重悬细胞。
h.重复4f-4g步骤1-2次。
i.流式细胞仪检测，或将细胞转移至多孔板、细胞培养皿或者细胞爬片上，在荧光显微镜下观察。
注：如果需要在载玻片或盖玻片上粘附悬浮细胞，可选用碧云天的Poly-D-lysine/多聚赖氨酸(ST508)处理载玻片或盖玻片。
5.固定细胞或组织冰冻切片样品的染色。
a.使用免疫染色固定液(P0098)或4%多聚甲醛固定液(P0099)进行固定。
注：由于固定可能会降低β-gal的活性，请摸索最佳固定液和固定时间。通常可以固定10-30分钟。
b.吸除固定液，用PBS洗涤细胞3次。
c.加入适当体积步骤1b (b)配制的SA-Green染色工作液B，轻轻晃动使染料均匀覆盖所有细胞或样品。
d.避光孵育0.5小时，最佳染色时间需要根据实验条件摸索，以达到最佳的荧光染色效果。
e.吸除SA-Green染色工作液B，用PBS洗涤2-3次。
f.直接在荧光显微镜或激光共聚焦显微镜下观察，或使用抗荧光淬灭封片液(P0126)或抗荧光淬灭封片液(含DAPI) (P0131)封片后，在荧光显微镜或激光共聚焦显微镜下观察。
注1：如果细胞贴壁不太好，各溶液加入时请沿着孔板壁缓慢加入，然后轻轻混匀，以避免细胞被冲散。
注2：在固定细胞染色孵育过程中请勿使用CO2培养箱。若在CO2培养箱中进行孵育，培养箱中的CO2可能会影响缓冲液的pH值使其呈酸性，进而导致内源性β-gal活性的背景升高，难以区分正常细胞和衰老细胞。
6.参数设置。
检测不同组别细胞荧光的强弱，通常可使用常见的绿色荧光的参数设置，例如激发波长为488的荧光通道进行检测。流式细胞检测时的推荐通道为FITC (Ex/Em=488/525)。
参考文献：
1.Baker DJ, Childs BG, Durik M, Wijers ME, Sieben CJ, et al. Nature. 2016. 530(7589):184-9.
2.Baker DJ, Wijshake T, Tchkonia T, LeBrasseur NK, Childs BG, et al. Nature. 2011. 479(7372):232-6.
3.Huang W, Hickson LJ, Eirin A, Kirkland JL, Lerman LO. Nat Rev Nephrol. 2022. 18(10):611-627.
4.Birch J, Gil J. Genes Dev. 2020. 34(23-24):1565-1576.
5.Itahana K, Campisi J, Dimri GP. Methods Mol Biol. 2007. 371:21-31.
相关产品：

产品编号	产品名称	包装
C0602	细胞衰老β-半乳糖苷酶染色试剂盒	>100次
C0603-0.1ml	Senescence-Tracker™衰老细胞近红外荧光探针	10mM×0.1ml
C0603	Senescence-Tracker™衰老细胞近红外荧光探针	1mg/5mg/25mg
C0605	溶酶体β-半乳糖苷酶染色试剂盒	>100次
C0607	Senescence-Tracker™衰老细胞绿色荧光染色试剂盒(SA-Green)	200次/1000次
C2035S	DNA损伤检测试剂盒(γ-H2AX免疫荧光法)	>100次
C2036S	DNA损伤检测试剂盒(γ-H2AX免疫荧光法, 兔单抗, 红色)	>100次
C2037S	DNA损伤检测试剂盒(γ-H2AX免疫荧光法, 鼠单抗, 绿色)	>100次
C2038S	DNA损伤检测试剂盒(γ-H2AX免疫荧光法, 鼠单抗, 红色)	>100次
C2041	彗星电泳试剂盒	20次/100次
D8021	人端粒酶活性检测试剂盒(TERT mRNA探针法)	50次/200次
D8025	人端粒长度染料法qPCR检测试剂盒	50次/200次