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细胞相关> 细胞样品制备> 细胞组分分离
人外周血淋巴细胞分离液
产品编号: C0025-200ml
产品包装:200ml
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C0025-200ml 人外周血淋巴细胞分离液 200ml 196.00元

碧云天生产的人外周血淋巴细胞分离液(Human Peripheral Blood Lymphocyte Separation Medium)是一种基于密度梯度离心原理,简单、快速、高效地从人外周血、脐带血或骨髓细胞中分离出淋巴细胞和单核细胞等细胞的分离液,也称为淋巴细胞分离液(Lymphocyte Separation Medium, LSM)、淋巴细胞梯度分离液、Density gradient medium、PBMC分离液、PBMC样本密度分离液或PBMC细胞分离液。本分离液的密度为1.077g/ml (20ºC),与外周全血近于等渗。本分离液和Ficoll-Paque 1.077、Ficoll-Hypaque、Histopaque-1077等在功能和使用方法上几乎完全一致。

人外周血细胞包括红细胞(Red blood cell, RBC, 即Erythrocyte)、白细胞(White blood cell, WBC, 即Leukocyte)和血小板(Platelet)。红细胞是血液中数量最多的一类血细胞,是血液运送氧气最主要的媒介,哺乳动物成熟的红细胞是无核的;白细胞是一种不均一的细胞群,生理学上根据其形态、功能和来源分为多核的粒细胞(Granulocyte,包括中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞)及单核的细胞(Peripheral blood mononuclear cell, PBMC,包括淋巴细胞(Lymphocyte)和单核细胞(Monocyte));血小板是从骨髓成熟的巨核细胞胞浆裂解脱落下来的小块胞质,体积很小,具有凝血、止血功能[1]。

淋巴细胞是体积最小的白细胞,约占白细胞的20-40% [2]。淋巴细胞由淋巴器官产生,主要存在于淋巴管中循环的淋巴液里,是具有特异免疫识别功能的细胞系,在机体抗炎症、抗感染及抗肿瘤等免疫过程中发挥着重要作用[3,4]。根据发生迁移、表面分子和功能的不同,淋巴细胞分为T淋巴细胞、B淋巴细胞和自然杀伤(NK)细胞三大类。其中T淋巴细胞和B淋巴细胞均来自造血组织。T淋巴细胞参与细胞免疫(Cell-mediated immunity),主要免疫功能包括抗胞内感染、抗瘤细胞和异体细胞等。目前有重要临床应用的CAR-T (Chimeric antigen receptor T cell,嵌合抗原受体T细胞)就是一种基于T淋巴细胞的细胞免疫疗法。B淋巴细胞参与体液免疫(Humoral immunity),其主要功能是产生抗体,提呈抗原及分泌细胞因子参与免疫调节;NK细胞由骨髓中的淋巴干细胞分化而来,可直接发挥细胞毒性效应,杀伤病毒感染细胞、肿瘤细胞和异体细胞。淋巴细胞检测是临床血常规项目之一,淋巴细胞异常提示细菌感染、病毒感染、淋巴细胞系统增殖性疾病、再生贫血障碍等。因此,分离和检测淋巴细胞具有重要临床意义。

人外周血中不同血细胞的体积、形态和比重(密度)有所差异:红细胞和粒细胞的比重较大,约1.092;单核的细胞(淋巴细胞和单核细胞)的比重约为1.075,血小板约为1.030 [5]。因此利用一种分离液,其比重在1.075-1.090之间,淋巴细胞和单核细胞由于比重较小在这种分离液中浮起,而红细胞和粒细胞的比重较大,在该分离液中将下沉,从而将单核的细胞从外周血细胞中分离出来。最常用的分离液是采用聚蔗糖(Polysucrose 400/Ficoll 400)和泛影酸钠(Sodium diatrizoate)配制的混合比重约1.070的溶液[6]。

碧云天的人外周血淋巴细胞分离液经过一定的配方优化和改良,20ºC时的密度约为1.077g/ml,和外周血近于等渗。通过本分离液进行密度梯度离心,离心管中的细胞或液体由上至下分四层:血浆和血小板密度较低,悬浮于分离液的上部,为第一层;单核的细胞(PBMC,包含淋巴细胞和单核细胞)的密度稍低于分离液,位于分离液界面之上,一般为环状乳白色,为第二层,所以移去第一层就可获得PBMC;第三层为透明分离液层;红细胞与粒细胞密度较大,沉于底部,为第四层。

图1. 人外周血淋巴细胞分离液(C0025)分离人外周血效果示意图。

本产品操作简单,操作时间短,分离率高。整个实验只需要简单的移液、离心操作,即可在约1个小时内完成样品淋巴细胞的分离。本产品对于淋巴细胞分离的提取率大于80%。如需获得高纯度目的细胞,可配合使用免疫磁珠进行分选。使用本试剂盒预分离,可减少磁珠的使用量,降低成本。

本产品品质高,质量控制严格。本分离液使用药用级原料,配方经过优化处理,无菌,内毒素小于0.5EU/ml。

本产品应用范围广。本产品不仅适用于稀释后的抗凝血液样品,也可用于未经稀释的抗凝血液样品;可分离淋巴细胞,还可分离一定纯度的血浆;分离得到的淋巴细胞可直接检测,也可进行细胞培养。

按使用说明操作,样品体积为5ml时,200ml本产品可进行约40次淋巴细胞分离。

包装清单:
产品编号 产品名称 包装
C0025-200ml 人外周血淋巴细胞分离液 200ml
说明书 1份
保存条件:

室温避光保存,两年有效。本产品严禁冷藏或冷冻保存。

注意事项:

使用本产品前须颠倒混匀,并在无菌条件下吸取,避免微生物污染。

如果要对分离的淋巴细胞进一步培养,须在收集血液和分离过程中,注意无菌操作,避免微生物污染。

本产品宜室温保存,严禁冷藏冷冻保存。低温条件下,本产品会出现白色结晶,影响分离效果。

由于本产品在低温时密度升高,而在高温的时候密度会降低,因此使用本产品的温度要求是18-22ºC,最佳分离温度是20ºC。

不同血液样品,分离效果不同。相比外周血,脐带血由于离体时间较长、运输等因素可能导致其分离效果不佳。血液样品宿主的身体状况、使用药物情况、患病情况及性别等因素均可能影响分离效果。

部分塑料的离心管(如聚苯乙烯, PS)带有静电,可能会导致细胞挂壁,影响分离效果。推荐使用碧云天聚丙烯材质的离心管(FTUB515/FTUB550)。

为避免细胞活性降低和提高淋巴细胞分离效果,请选用不含有钙镁离子的缓冲液或生理盐水对血液样品进行稀释。

由于不同种属动物免疫细胞密度的差异,本产品仅适用于人外周血淋巴细胞分离,不适用于其它动物。不同动物血液须选用特定的分离液。

本产品仅限于专业人员的科学研究用,不得用于临床诊断或治疗,不得用于食品或药品,不得存放于普通住宅内。

为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用说明:
1.实验前准备:
a.需自备水平转子离心机(离心力≥1200×g)。整个梯度离心要求是慢升慢降,需要设置离心机的加速度为1-3,关闭刹车,须自然停止。
b.抗凝剂的选择:若分离出的淋巴细胞直接用于检测,可选用枸橼酸钠抗凝剂;若分离出的淋巴细胞需进一步培养,则选用肝素抗凝剂。
c.血液样品应是新鲜抗凝血,避免冷藏或冷冻。血液样品离体2小时内分离效果最佳;血液样品离体2-4小时,分离效果尚可;血液样品离体4小时以上,分离效果差或无法进行分离操作。
d.为保证最佳分离效果,整个实验过程要求检测样品、使用试剂、离心及实验室的温度均保持在20±2ºC。
2.血液样品的稀释(选做):
a.选用不含有钙镁离子缓冲液或生理盐水或培养基对样品进行稀释。推荐选择碧云天生产的PBS (C0221A)和生理盐水(ST341)。
b.按照血液样品:PBS或生理盐水=2:1的比例对血液样品进行稀释。
3.淋巴细胞的分离:
a.分离液和血液样品的加入:取一支新的15ml或50ml无菌离心管,先加入一定量分离液;随后将管子小心地倾斜45度,并沿着壁管缓慢地加入血液样品,使样品顺着管壁缓慢滑动到接近分离液液面处,避免血液样品冲入液面下,此时血液样品平铺在分离液的液面上,注意保持两液面界面清晰,切勿搅动液面或摇晃、混匀。
注1:可以使用无菌巴氏吸管(FPIP002/FPIP004/FPIP008)吸取血液样品或后续的血浆层、淋巴细胞。
注2:由于分离液和血液的密度差异,将形成明显的分层界面。如果样品较多导致加样时间较长,在离心前出现红细胞成团下沉属正常现象。
注:3:如果使用特殊的外周血淋巴细胞分离管如SepMate™ PBMC Isolation Tube等进行分离,请同时参考该离心管的使用说明进行操作。
b.当样品体积小于3ml时,加入3ml分离液,然后按15ml离心管进行操作;当样品体积在3-20ml范围内时,分别按15ml (步骤c)、50ml (步骤d)两种规格的离心管进行操作。
注1:可将血液样品和分离液置于20ºC水浴中孵育20分钟,以保证最佳分离温度。
注2:分离液体积不得少于3ml。
c.对于15ml离心管:
(1) 稀释过的血液样品:推荐最佳比例为5ml分离液+4ml稀释后的血液样品;推荐最佳离心条件为20ºC,500×g,离心25分钟。
(2) 未稀释的血液样品:推荐最佳比例为5ml分离液+5ml血液样品;推荐最佳离心条件为20ºC,600×g,离心25分钟。
d.对于50ml离心管:
(1)稀释过的血液样品:推荐最佳比例为20ml分离液+20ml稀释后的血液样品;推荐最佳离心条件为20ºC,650×g,离心30分钟。
(2)未稀释的血液样品:推荐最佳比例为20ml分离液+20ml血液样品;推荐最佳离心条件为20ºC,600×g,离心30分钟。
e.条件的优化:
(1)根据离心后乳白色环状层(淋巴细胞层)显现状态,调整样品稀释倍数。乳白色环状层弥散,应适当提高样品的稀释倍数;乳白色环状层很浅或没有,应适当降低样品的稀释倍数。
(2)根据离心后淋巴细胞存在的分层位置,可适当调整离心力。离心后淋巴细胞在血浆层,适当提高离心力;离心后淋巴细胞在分离液层,则适当降低离心力。
(3)若出现红细胞沉降不完全的情况,可以适当加大离心力。
(4)若出现血小板污染的情况,可适当降低离心力,同时分离后可增加洗涤次数。
(5)离心力的调整以50-100×g为基数,直至达到最佳分离效果。离心力最小不可小于400×g,最大不可大于1200×g。离心时间以20-30分钟为准。
(6)地域差异、四季温差及离心机性能差异等均会影响分离效果,可根据实际情况,调整离心条件。建议对离心条件进行调整时,恒定离心时间,对离心转速进行调整。
f.血浆层的吸取:小心、缓慢地吸取血浆层并转移到新的离心管中,勿触动PBMC层,可留少量血浆层。血浆层样品后续可用于血浆相关检测。如需获得纯度较高的血浆,建议仅吸取血浆层由上至下的2/3的血浆,剩余1/3血浆可能包含部分PBMC及少量分离液成分。离心后的分离效果示意图请参考图1,由上到下分为四层,依次为血浆层(含血小板)、乳白色环状层(即PBMC层)、透明分离液层和红细胞/粒细胞层。离心后须小心取出离心管,切勿摇晃或震动。
g.淋巴细胞的吸取:可直接穿过血浆层,小心、缓慢地吸取乳白色环状层(即PBMC层)并转移到新的离心管中(此方法技术要求高),也可以在尽量吸除血浆层后再小心、缓慢地吸取乳白色环状层,并转移到新的离心管中。
注1:为避免吸取存在分离液交界处的粒细胞,请不要过多吸取淋巴细胞层。
注2:若吸取的淋巴细胞层混杂有红细胞,可使用红细胞裂解液(C3702)将红细胞裂解,以去除红细胞,提高淋巴细胞分离率。
h.洗涤I:加入10ml PBS或HBSS (C0218),适当混匀,重悬细胞。250×g离心10分钟,弃上清。
i.洗涤II:加入5ml PBS或HBSS,适当混匀,重悬细胞。250×g离心10分钟,弃上清。重复本步骤2-3次。
j.所得沉淀即为分离的淋巴细胞,可加入0.5ml PBS或HBSS或根据后续实验要求加入相应溶液,重悬细胞。
参考文献:
1.Barbara J. Bain. Medicine. 2021. 49(4):183-188
2.Mathur A, Tripathi AS, Kuse M. J Pathol Inform. 2013. 4(Suppl): S15.
3.Sknepnek A, Tomić S, Miletić D, et al. Food Chem. 2021. 342:128344.
4.Udyavar A, Geiger TL. Arch Immunol Ther Exp (Warsz). 2010. 58(5):335-46.
5.王兰兰主编. 医学检验专业必修课考试辅导教材, 临床免疫学和免疫检验, 科学技术文献出版社. 2004年10月第1版, 第111页.
6.Böyum A. Scand J Clin Lab Invest Suppl. 1968. 97:77-89.
常见问题:
由于血液黏度、样品稀释倍数等差异可能产生的问题及解决方案如下表所示。
Problem Cause Resolution
离心后淋巴细胞存在于血浆层 离心力过小或离心时间过短 调整离心力
离心后淋巴细胞存在于透明分离液层中 离心力过大或离心时间过长
离心后乳白色环状层(淋巴细胞层)弥散 样品未稀释或者稀释倍数过低 调整样品稀释倍数
离心后乳白色环状层(淋巴细胞层)太浅或看不见 样品稀释倍数过高
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