使用说明：
1. PCR产物或酶切片段和普通载体的连接：
   a. 取1-2μg载体酶切过夜，或至少酶切3-5小时以上。尽量确保酶切充分，否则后续会导致产生很多
      自连的克隆。
   b. 载体酶切完毕后，可以使用试剂盒进行纯化，例如碧云天的PCR纯化试剂盒/DNA纯化试剂盒
      (D0033)。也可以采用常规的酚氯仿抽提乙醇沉淀方法纯化载体。对于酶切产生较大片段(大于50-
      60bp)的情况推荐采用切胶回收的方式。
   c. 对于PCR产物：PCR产物凝胶电泳后，切胶回收预期大小的DNA片段。凝胶中DNA片段的回收可以使
      用试剂盒进行操作，例如碧云天的DNA凝胶回收试剂盒(D0056)。也可以采用反复冻融等方法回收
      DNA片段。
   d. 对于回收的PCR产物或其它需酶切的质粒或DNA片段，用适当内切酶酶切，随后纯化酶切产物。
      注：这一步的酶切不必酶切特别充分，通常酶切效率能达到80-90%以上即可。即本步骤的酶切
      通常酶切1-2小时即可。酶切产物可以使用试剂盒进行纯化，例如碧云天的PCR纯化试剂盒/DNA纯
      化试剂盒(D0033)。也可以采用常规的酚氯仿抽提乙醇沉淀方法纯化载体。
   e. 取约25-100ng经过酶切和纯化的载体，加入3倍摩尔数的待插入片段。参考下表设置连接反应体
      系。
      注：很多时候由于载体量和待插入片段的量都比较少，在回收后很难定量。此时可以根据回收前
      电泳条带的亮度进行大致的估计。通常以DNA分子量标准的某一条带为参考，估计或通过灰度半定
      量您的目的条带和该参考条带的亮度的比例关系。然后再按照预计的纯化或凝胶回收时的得率计
      算出最终得到的载体量和待插入片段量的比例关系。

   f. 用移液器轻轻吹打混匀或轻微Vortex混匀，室温离心数秒，使液体积聚于管底。
   g. 室温(25℃)孵育连接5-10分钟或更长时间。对于双平端连接需室温(25℃)孵育15-30分钟或更长时
      间。
      注1：对于双粘端连接：室温孵育5-10分钟通常可以达到孵育更长时间所能达到最佳连接效率的
      70%以上。室温孵育60分钟和16℃孵育过夜相比，无显著差异。连接5-10分钟后，如果转化等后续
      步骤还没有准备好，完全可以适当延长连接时间。但通常不宜超过60分钟。如果可能超过60分
      钟，可以在4℃或16℃放置较长时间甚至过夜。
      注2：对于双平端连接：室温孵育15分钟通常可以达到孵育更长时间所能达到最佳连接效率的
      70%以上。室温孵育60分钟和16℃孵育过夜相比，无显著差异。连接15分钟后，如果转化等后
      续步骤还没有准备好，完全可以适当延长连接时间。但通常不宜超过60分钟。如果可能超过60分
      钟，可以在4℃或16℃放置较长时间甚至过夜。
      注3：上述室温连接效率的数据在25℃时获得，在20-27℃时获得的连接效率比较接近。室温较低
      或较高时推荐在25℃水浴进行连接。
   h. 随后即可直接取连接产物用于转化感受态细菌。
2. PCR产物和T载体的连接：
   a. PCR产物凝胶电泳后，切胶回收预期大小的DNA片段。凝胶中DNA片段的回收可以使用试剂盒进行操
      作，例如碧云天的DNA凝胶回收试剂盒(D0056)。也可以采用反复冻融等方法回收DNA片段。
   b. 按照T载体的说明书取适量T载体，加入3倍摩尔数的待插入片段。参考下表设置连接反应体系。
      注：很多时候由于载体量和PCR产物的量都比较少，在回收后很难定量。此时可以根据回收前电
      泳条带的亮度进行大致的估计。通常以DNA分子量标准的某一条带为参考，估计或通过灰度半定量
      您的目的条带和该参考条带的亮度的比例关系。然后再按照预计的纯化或凝胶回收时的得率计算
      出最终得到的载体量和PCR产物的量的比例关系。

   c. 用移液器轻轻吹打混匀或轻微Vortex混匀，室温离心数秒，使液体积聚于管底。
   d. 室温孵育5-10分钟或更长时间。
      注：室温孵育5-10分钟通常可以达到孵育更长时间所能达到最佳连接效率的70%以上。室温孵育
      30分钟和16℃孵育过夜相比，无显著差异。连接5-10分钟后，如果转化等后续步骤还没有准备
      好，完全可以适当延长室温的连接时间。但通常不宜超过60分钟。如果可能超过60分钟，可以在
      4℃或16℃放置较长时间甚至过夜。
   e. 随后即可直接取连接产物用于转化感受态细菌。
3. Linker或RNAi片段和载体的连接：
   a. 载体的酶切和纯化同步骤1a和1b。
   b. Linker或RNAi片段的退火可以选择适当的DNA退火缓冲液，例如碧云天的Annealing Buffer for
      DNA Oligos(5X)(D0251)， 进行退火反应。
   c. 长度大于8bp的Linker或退火的RNAi片段，可以按照5:1至10:1的比例和载体进行连接反应。例如
      载体为0.03pmol，则插入片段可以为0.15至0.3pmol。长度小于8bp的linker，比例需调整为10:1
      以上。
   d. 除插入片段的用量外，随后按照步骤1e-1h进行。
4. DNA自身环化的连接：
   参考步骤1e，待插入片段换成适量的水即可。其余步骤按照步骤1f，1g，和1h进行。
5. 其它类型的DNA片段连接参考上述方法进行。

常见问题：
1. 连接反应后转化效率很低或阳性克隆非常少：
   a. 可能在加入快速连接缓冲液(2X)后没有充分混匀。
   b. 可以尝试提高载体或插入片段的纯度。对于平端连接需注意适当延长连接时间。
   c. 可能载体酶切不够充分，用未经连接的载体转化作为阴性对照。
   d. 用存放DNA的溶液进行转化，作为阴性对照，检测感受态细菌是否存在问题。

使用本产品的文献：
1. Shi Y, Huang H, Deng X, He X, Yang J, Yang H, Shi L, Mei L, Gao J, Zhou N.
   Identification and functional characterization of two orphan G-protein-coupled receptors
   foradipokinetic hormones from silkworm Bombyx mori.
   J Biol Chem. 2011 Dec 9;286(49):42390-402.
2. Yang J, Huang H, Yang H, He X, Jiang X, Shi Y, Alatangaole D, Shi L, Zhou N.
   Specific activation of the G protein-coupled receptor BNGR-A21 by the neuropeptide
   corazonin from the silkworm, Bombyx mori, dually couples to the G(q) and G(s) signaling
   cascades.
   J Biol Chem. 2013 Apr 26;288(17):11662-75. doi: 10.1074/jbc.M112.441675.
3. Deng X, Yang H, He X, Liao Y, Zheng C, Zhou Q, Zhu C, Zhang G, Gao J, Zhou N.
   Activation of Bombyx neuropeptide G protein-coupled receptor A4 via a Gαi-dependent
   signaling pathway by direct interaction with neuropeptide F from silkworm, Bombyx mori.
   Insect Biochem Mol Biol. 2014 Feb;45:77-88. doi: 10.1016/j.ibmb.2013.12.007.
   Epub 2013 Dec 27.
4. Chen X, Zheng C, Qian J, Sutton SW, Wang Z, Lv J, Liu C, Zhou N.
   Involvement of β-arrestin-2 and clathrin in agonist-mediated internalization of the
   human cannabinoid CB2 receptor.
   Curr Mol Pharmacol. 2014;7(1):67-80.
5. Yang W, X Dai, M Liu.
   Development of an Indirect Competitive Enzyme-linked Immunosorbent Assays Method Based on
   Immunomagetic-bead for Analyzing Listeria monocytogenes in Food.
   Am J Food Technol. 2016;11(3):100-107.