碧云天研发生产的One-step mRNA Capping Kit，即一步法mRNA加帽试剂盒,是一种包含Faustovirus Capping Enzyme (FCE)、mRNA Cap 2'-O-Methyltransferase (mRNA 2'-O-MTase)、GTP和S-adenosylmethionine (SAM)以及加帽反应所需要的缓冲液，可仅通过一步反应就可以添加Cap-1帽结构至mRNA的试剂盒。

本试剂盒对mRNA添加Cap-1帽结构的原理请参考图1。

图1. 碧云天One-step mRNA Capping Kit (R7055)给mRNA添加Cap-1帽结构的原理图。首先，FCE通过其RNA三磷酸酶活性将mRNA 5'-三磷酸(5'pppN−)裂解为二磷酸(5'ppN−)；然后，FCE通过其RNA鸟苷酸转移酶活性将GTP连接到mRNA N1的5'-二磷酸形成未甲基化的G帽结构(5'GpppN−)；接着，FCE通过其鸟嘌呤7-甲基转移酶活性，以S-腺苷甲硫氨酸作为甲基供体，催化G帽的N7位置的甲基化，产生带有Cap-0帽结构的mRNA；最后，mRNA Cap 2'-O-Methyltransferase以S-腺苷甲硫氨酸作为甲基供体，催化mRNA的5'末端紧挨Cap-0帽结构的第一个核苷酸的2'-O位置添加一个甲基基团，产生带有Cap-1帽结构的mRNA。

碧云天One-step mRNA Capping Kit (R7055)对EGFP mRNA加帽后的细胞转染效果请参考图2。

图2. 碧云天One-step mRNA Capping Kit (R7055)催化在EGFP mRNA的5'末端形成Cap-1帽结构，然后将该mRNA转染293T细胞表达EGFP蛋白的效果图。在25μl反应体系(Capping Buffer (1X), 5μg EGFP mRNA, 0.8U/μl RNase Inhibitor (R0101/R0102/R0105/R0106), 0.5mM GTP, 0.2mM SAM)中加入1μl Faustovirus Capping Enzyme和2μl mRNA Cap 2'-O-Methyltransferase，37ºC孵育60分钟反应生成Cap-1帽结构，70ºC孵育10分钟以终止反应。25万个293T (人胚肾细胞) (C6008)在BeyoGold™ 24孔细胞培养板(FCP243)中培养24小时，每孔使用Lipo8000™转染试剂(C0533)转染500ng未添加或添加Cap-1帽结构的EGFP mRNA，继续培养24小时后使用荧光显微镜进行拍照。如图所示，本产品具有很好的加帽效果。A和B分别为不加帽EGFP mRNA转染后的的明场图片和荧光图片，C和D分别为使用本产品添加Cap-1帽结构的EGFP mRNA转染后的明场图片和荧光图片。EGFP mRNA的制备方法：首先以带有T7 Promoter的EGFP完整编码序列的线性化质粒DNA为模板，使用T7 RNA Polymerase (D7069/R7012/R7013)和ATP (100mM, Nuclease free) (D7378)、CTP (100mM, Nuclease free) (D7379)、GTP (100mM, Nuclease free) (D7380)以及UTP (100mM, Nuclease free) (D7381)，或T7 High Yield RNA Transcription Kit (R7018)，或T7 Quick High Yield RNA Transcription Kit (R7016)转录获得EGFP mRNA。实际检测效果会因实验条件、检测仪器等的不同而存在差异，图中效果仅供参考。

Faustovirus Capping Enzyme，即Faustovirus加帽酶，是一种表达纯化获得的来自Faustovirus S17菌株的单亚基mRNA加帽酶。FCE具有给mRNA添加Cap-0帽结构所需的三种酶活性，即三磷酸酶(Triphosphatase, TPase)、鸟嘌呤转移酶(Guanylyltransferase, GTase)和(鸟嘌呤-N7)-甲基转移酶((Guanine-N7)-Methyltransferase, N7 MTase)的活性，它可在真核生物mRNA的5'末端的三磷酸和二磷酸位置催化加入N7-甲基鸟苷帽结构(m⁷GpppNp)，从而产生带有Cap-0帽结构的mRNA [1]。Cap-0帽结构可以通过保护mRNA免遭5'→3'核糖核酸外切酶降解来增加mRNA稳定性[2]，还可防止三磷酸化的mRNA激活机体的天然免疫反应[3]。

mRNA Cap 2'-O-Methyltransferase，即mRNA Cap 2'-O甲基转移酶，可以利用S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine, SAM)作为甲基供体，在mRNA的5'末端紧挨Cap-0帽结构(m⁷GpppNp)的第一个核苷酸的2'-O位置添加一个甲基基团，产生带有Cap-1帽结构(m⁷GpppN^mp)的mRNA。Cap-1帽结构不仅可以增强mRNA的稳定性和翻译效率，进而提高mRNA在显微注射(Microinjection)和转染(Transfection)后的表达水平[4]，还可以帮助mRNA逃避体内某些细胞的先天免疫反应[5]。

用途：体内或体外翻译前mRNA的加帽；mRNA的5'末端标记；Cap-1帽结构中的2'-O甲基化有助于mRNA逃避某些体内细胞的先天免疫反应；提高mRNA的翻译效率；提高mRNA在显微注射(Microinjection)和转染(Transfection)后的蛋白表达水平。

按照使用说明操作，本试剂盒小包装可以进行20次加帽反应，中包装可以进行100次加帽反应。

-20ºC保存，至少两年有效。

本产品使用时宜放在冰盒内或冰浴上，使用完毕后宜立即放置于-20ºC保存。

由于涉及RNA操作，须严格按照RNA操作的规范进行，避免RNase污染。

实验中用到的吸头、离心管等实验耗材必须为RNase free的或须经DEPC处理，推荐选购碧云天的BeyoGold™系列中无RNase和DNase污染的耗材产品。不含RNase的超纯水推荐使用碧云天的BeyoPure™ Ultrapure Water (DNase/RNase-Free, Sterile) (ST876)或DEPC水(DNase、RNase free) (R0021/R0022)。

桌面等环境以及仪器设备表面的RNase、DNase、RNA和DNA的去除推荐使用碧云天的RNase, DNase, RNA and DNA Away (R0127)进行快速处理。

可根据具体应用选择合适的操作方法，可能需准备额外的试剂，如RNase Inhibitor、超纯水等。

SAM在pH值为7-8，37ºC条件下不稳定，建议在反应开始前根据实际反应数配制新鲜的工作液并放置于冰上，防止SAM降解。

本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。

为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。