碧云天研发生产的mRNA Cap 2'-O-Methyltransferase (简称mRNA 2'-O-MTase)，即mRNA Cap 2'-O-甲基转移酶，是由碧云天自主研发的PerfectProtein™技术平台表达、纯化获得的一种在mRNA Cap-0帽结构基础上产生Cap-1帽结构的mRNA加帽酶。mRNA Cap 2'-O-Methyltransferase可以利用S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine, SAM)作为甲基供体，在mRNA的5'末端紧挨Cap-0帽结构(m7GpppNp)的第一个核苷酸的2'-O位置添加一个甲基基团，产生带有Cap-1帽结构(m⁷GpppNmp)的mRNA。Cap-1帽结构不仅可以增强mRNA的稳定性和翻译效率，进而提高mRNA在显微注射(Microinjection)和转染(Transfection)后的表达水平[1]，还可以帮助mRNA逃避体内某些细胞的先天免疫反应[2]。

mRNA Cap 2'-O-Methyltransferase只能作用于带有N7-甲基鸟苷帽结构(m7GpppNp)，即带有Cap-0帽结构的mRNA，不会作用于5'末端为pN、ppN、pppN或GpppN的mRNA [3]。通常可使用Faustovirus Capping Enzyme (R7051)制备带Cap-0帽结构的mRNA，然后使用mRNA Cap 2'-O-Methyltransferase添加Cap-1帽结构；也可以与Faustovirus Capping Enzyme协同作用，一步添加Cap-1帽结构至mRNA。

本产品对mRNA添加Cap-1帽结构的原理请参考图1。

图1. 碧云天mRNA Cap 2'-O-Methyltransferase (R7053)对mRNA添加Cap-1帽结构的原理图。mRNA Cap 2'-O-Methyltransferase以S-腺苷甲硫氨酸(SAM)作为甲基供体，催化mRNA的5'末端紧挨Cap-0帽结构的第一个核苷酸的2'-O位置添加一个甲基基团，产生带有Cap-1帽结构的mRNA。

碧云天mRNA Cap 2'-O-Methyltransferase (R7053)对EGFP mRNA加帽后的细胞转染效果请参考图2。

图2. 碧云天mRNA Cap 2'-O-Methyltransferase (R7053)和N公司的同类产品(Competitor)在EGFP mRNA的Cap-0帽结构基础上产生带有Cap-1帽结构，然后将该mRNA转染293T细胞表达EGFP蛋白的效果图。在25μl反应体系(50mM Tris-HCl (pH8.0 @ 25ºC), 5mM KCl, 1mM MgCl₂, 1mM DTT, 0.02% Poloxamer 188, 5μg EGFP mRNA, 0.8U/μl RNase Inhibitor (R0101/ R0102/ R0105/R0106), 0.5mM GTP (100mM, Nuclease free) (D7380), 0.2mM SAM)中分别加入25U Faustovirus Capping Enzyme (R7051)，之后加入或不加入100U的本产品或N公司(Competitor)的mRNA Cap 2'-O-Methyltransferase，37ºC孵育60分钟反应生成Cap-1帽结构，70ºC孵育10分钟以终止反应。25万个293T (人胚肾细胞) (C6008)在BeyoGold™ 24孔细胞培养板(FCP243)中培养24小时，每孔使用Lipo8000™转染试剂(C0533)转染500ng未添加或添加Cap-1帽结构的EGFP mRNA，继续培养24小时后使用荧光显微镜进行拍照。如图所示，本产品与N公司的产品相比，具有类似的催化效果，与Faustovirus Capping Enzyme相比，提高了EGFP的翻译效率。a和b分别为未加帽EGFP mRNA转染后的明场图片和荧光图片；c和d分别为使用碧云天mRNA Cap 2'-O-Methyltransferase添加Cap-1帽结构的EGFP mRNA转染后的明场图片和荧光图片；e和f分别为使用N公司的mRNA Cap 2'-O-Methyltransferase添加Cap-1帽结构的EGFP mRNA转染后的明场图片和荧光图片；g和h分别为使用碧云天的Faustovirus Capping Enzyme添加Cap-0帽结构的EGFP mRNA转染后的明场图片和荧光图片；i和j分别为使用N公司的Faustovirus Capping Enzyme添加Cap-0帽结构的EGFP mRNA转染后的明场图片和荧光图片。EGFP mRNA的制备方法：首先以带有T7 Promoter的EGFP完整编码序列的线性化质粒DNA为模板，使用T7 RNA Polymerase (D7069/R7012/R7013)和ATP (100mM, Nuclease free) (D7378)、CTP (100mM, Nuclease free) (D7379)、GTP (100mM, Nuclease free) (D7380)以及UTP (100mM, Nuclease free) (D7381)，或T7 High Yield RNA Transcription Kit (R7018)，或T7 Quick High Yield RNA Transcription Kit (R7016)转录获得EGFP mRNA。实际检测效果会因实验条件、检测仪器等的不同而存在差异，图中效果仅供参考。

用途：体内或体外翻译前mRNA的加帽；Cap-1帽结构中的2'-O甲基化有助于mRNA逃避体内某些细胞的先天免疫反应；提高mRNA的翻译效率；提高mRNA在显微注射(Microinjection)和转染(Transfection)后的表达水平。

来源：由大肠杆菌表达牛痘病毒的mRNA Cap 2'-O-甲基转移酶基因，经纯化而获得。

活性单位定义：One unit of mRNA Cap 2'-O-Methyltransferase is defined as the amount of enzyme required to methylate 10pmoles of 80nt long capped RNA transcript in 1 hour at 37ºC.

纯度：不含DNA内切酶和外切酶，不含RNA酶，不含磷酸酯酶。

酶储存溶液：20mM Tris-HCl (pH8.0 @ 25ºC), 100mM NaCl, 1mM DTT, 0.1mM EDTA, 0.1% Triton X-100, 50% Glycerol.

Capping Buffer (10X)：500mM Tris-HCl (pH8.0 @ 25ºC), 50mM KCl, 10mM MgCl₂, 10mM DTT, 0.2% Poloxamer 188.

失活或抑制：70ºC加热10分钟可使mRNA Cap 2'-O-Methyltransferase失活。

-20ºC保存，至少两年有效。

本产品使用时宜放在冰盒内或冰浴上，使用完毕后宜立即放置于-20ºC保存。

由于涉及RNA操作，须严格按照RNA操作的规范进行，避免RNase污染。

实验中用到的吸头、离心管等实验耗材必须为RNase free的或须经DEPC处理，推荐选购碧云天的BeyoGold™系列中无RNase和DNase污染的耗材产品。不含RNase的超纯水推荐使用碧云天的BeyoPure™ Ultrapure Water (DNase/RNase-Free, Sterile) (ST876)或DEPC水(DNase、RNase free) (R0021/R0022)。

桌面等环境以及仪器设备表面的RNase、DNase、RNA和DNA的去除推荐使用碧云天的RNase, DNase, RNA and DNA Away (R0127)进行快速处理。

可根据具体应用选择合适的操作方法，可能需准备额外的试剂，如RNase Inhibitor、超纯水等。

SAM在pH值为7-8，37ºC条件下不稳定，建议在反应开始前根据实际反应数配制新鲜的工作液并放置于冰上，防止SAM降解。

本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。

为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。