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核酸相关> RNA相关> 切割、合成、连接和修饰
T3 RNA Polymerase
产品编号: R7009S
产品包装:1KU
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价格: ¥ 133.00
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产品编号 产品名称 产品包装 产品价格
R7009S T3 RNA Polymerase 1KU 133.00元
R7009M T3 RNA Polymerase 5KU 412.00元
R7009L T3 RNA Polymerase 25KU 1448.00元
R7009XL T3 RNA Polymerase 100KU 4867.00元

T3 RNA Polymerase,即T3 RNA聚合酶,是一种高度特异识别T3启动子序列的DNA依赖的5'→3' RNA聚合酶。T3 RNA Polymerase可以催化单链或双链DNA T3 启动子下游NTP的掺入,合成与T3启动子下游的模板DNA互补的RNA。

特点:T3 RNA Polymerase不仅可以进行常规的RNA合成,还可以识别修饰的NTP,例如生物素标记、地高辛标记、荧光素标记的NTP,可以用于各种标记RNA的合成。同时对于T3启动子有高度的特异性。

碧云天生产的T3 RNA Polymerase以带有T3 Promoter的线性化质粒DNA为模板进行转录时的效果参见图1。

图1. 碧云天生产的T3 RNA Polymerase与同类产品(Competitor)以带有T3 Promoter的线性化质粒DNA为模板进行体外转录时的效果图。在20µl反应体系(40mM Tris-HCl, pH7.9, 2mM Spermidine, 6mM MgCl2, 1mM DTT)中,加入0.2μg线性化质粒DNA,以及图中指定量的本产品或N公司(Competitor)的T3 RNA Polymerase,37℃孵育2h,70℃孵育10min终止反应,加入2U DNase I (D7073),37℃孵育15min消化模板DNA,得到的RNA转录产物为221nt。取出5μl反应产物,加入5μl 2X RNA Loading Buffer,70℃变性10min,然后进行1%琼脂糖凝胶电泳,用1X TAE作为电泳液,170V电泳5min,染色后拍照观察结果。如图所示,本产品与N公司的产品相比,具有相近或略优的转录效果。

用途:用于RNA合成,合成的RNA可以用于或用作:杂交探针,基因组DNA序列分析,核糖核酸酶保护测定(RNase protection assay),反义RNA合成,作为体外翻译的RNA模板,RNA剪接研究的底物,RNA二级结构和RNA-蛋白质相互作用,核酸扩增分析,siRNA、miRNA等小RNA。

来源:由大肠杆菌表达,表达基因为嗜菌体T3 RNA Polymerase基因。

活性定义:37℃ 60分钟内,催化1 nmol AMP 掺入到多聚核苷酸中所需的酶量定义为1个活性单位。

活性检测条件:40mM Tris-HCl (pH8.0),6mM MgCl2,10mM DTT,2mM spermidine,0.5mM NTP,0.6MBq/ml [3H]-ATP,20µg/ml plasmid DNA containing the specific T3 RNA Polymerase promoter sequence。

纯度:不含DNA内切酶和外切酶,不含RNA酶。

酶储存溶液:50mM Tris-HCl (pH7.9, 25℃), 100mM NaCl, 1mM DTT, 1mM EDTA, 50% (v/v) Glycerol, 0.1% (w/v) Triton X-100.

Transcription Buffer (10X):400mM Tris-HCl (pH7.9, 25℃), 20mM spermidine, 60mM MgCl2, 10mM DTT.失活或抑制:70℃加热10分钟可使T3 RNA Polymerase失活。加入适量EDTA也可以使T3 RNA Polymerase失活。螯合剂、浓度大于150mM的钠、钾或铵盐可以显著抑制T3 RNA Polymerase的活性。

T3 consensus promoter sequence如下,其中的G为转录的第一个碱基。

AATTAACCCTCACTAAAGGGAGA

包装清单:
产品编号 产品名称 包装
R7009S-1 T3 RNA Polymerase (50U/µl) 20µl
R7009S-2 10X T3 Transcription Buffer 25µl
说明书 1份

产品编号 产品名称 包装
R7009M-1 T3 RNA Polymerase (50U/µl) 100µl
R7009M-2 10X T3 Transcription Buffer 120µl
说明书 1份

产品编号 产品名称 包装
R7009L-1 T3 RNA Polymerase (50U/µl) 500µl
R7009L-2 10X T3 Transcription Buffer 600µl
说明书 1份

产品编号 产品名称 包装
R7009XL-1 T3 RNA Polymerase (50U/µl) 2.0ml
R7009XL-2 10X T3 Transcription Buffer 1.2ml×2
说明书 1份
保存条件:

-20℃保存。

注意事项:

酶使用时宜存放在冰盒内或冰浴上,使用完毕后宜立即放置于-20℃保存。

本产品仅限于专业人员的科学研究用,不得用于临床诊断或治疗,不得用于食品或药品,不得存放于普通住宅内。

为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用说明:
1.RNA合成:
a.DNA模板经限制性核酸内切酶酶切线性化。
b.酚/氯仿抽提DNA,用乙醇沉淀后,溶于适量的无菌去离子水中。本步骤也可以使用适当的DNA纯化试剂盒,例如碧云天的DNA纯化试剂盒(D0033),直接进行纯化,从而免去了酚氯仿抽提和乙醇沉淀这些步骤。
c.参考如下表格设置反应体系:
10X T3 Transcription Buffer 2µl
NTP Mixture (10mM each) 4µl
线性DNA模板 0.2-1µg
Ribonuclease Inhibitor (40U/µl) 0.5µl
T3 RNA Polymerase (50U/µl) 0.8-2µl U
补充经DEPC处理的去离子水 至20µl
d.按上表设置好反应体系后,轻轻混匀(可以用移液器吹打混匀或用Vortex在最低速度轻轻混匀),随后离心沉淀液体。
e.37℃孵育1~2个小时。
f.加入2µl 0.5M EDTA (pH 8.0)到反应体系中混匀或-20℃冷却终止反应。
g.电泳分析转录产物,或通过其他适当方法鉴定转录的效率。
注意:
a)转录需在无RNA酶条件下进行。
b)反应体系需在室温条件下配置,4℃有亚精胺(spermidine)存在时DNA可发生沉淀。
c)按以上反应条件,每1µg模板DNA可合成超过10µg的RNA。
d)如果模板DNA的线形化不太完全,会导致转录出比预期长度更长的RNA,同时使预期长度的转录本比例下降。
e)可根据实际情况按照比例放大或缩小上述反应体系。
2.放射标记RNA的合成:
a.DNA模板经限制性核酸内切酶酶切线性化。
b.酚/氯仿抽提DNA,用乙醇沉淀后,溶于适量的无菌去离子水中。本步骤也可以使用适当的DNA纯化试剂盒,例如碧云天的DNA纯化试剂盒(D0033),直接进行纯化,从而免去了酚氯仿抽提和乙醇沉淀这些步骤。
c.参考如下表格设置反应体系:
10X T3 Transcription Buffer 2µl
3 NTP Mixture (10mM each , without CTP) 1µl
100µM CTP 2.4µl
[α-32P]-CTP, ~30TBq/mmol(800Ci/mmol) 1.85MBq(50µCi)
线性DNA模板 0.2~1µg
Ribonuclease Inhibitor (40U/µl) 0.5µl
T3 RNA Polymerase (50U/µl) 1µl
补充经DEPC处理的去离子水 至20µl
d.37℃孵育1~2个小时。
e.-20℃冷却终止反应。
f.分析和检测RNA的标记效率。
注意:
a)按以上方法合成的RNA活性一般为3-5 x108 dpm/µg。
b)上述标记反应中也可以使用[32 P]、[35 S]或[3H]标记的其他NTP。使用其他放射性标记的NTP时,其他的NTP需作相应调整。20µl反应体系各成分推荐使用剂量分别为:1.85MBq (50µCi) 5'-[α-32P]-CTP, ~30TBq/mmol(800Ci/mmol);11.1MBq (300µCi) 5'-[α-35S]-UTP, >37TBq/mmol (>1000Ci/mmol);0.925MBq (25µCi) 5,6-[3H]-UTP, 1.1-2.2TBq/mmol (30-60Ci/mmol)。
c)放射性标记NTP浓度低于12µM时,全长转录本合成效率也会下降。
3.生物素标记、地高辛标记等其它用途可以参考上述用途或相关文献资料进行。
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产品编号 产品名称 包装
R0102-2kU RNase Inhibitor 2000U
R0102-10kU RNase Inhibitor 10000U
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R0107 氧钒核糖核苷复合物(RNase抑制剂) 2ml
R0108 氧钒核糖核苷复合物(RNase抑制剂) 10ml
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R7075 Poly(A) Polymerase Tailing Kit 50次
R0021 DEPC水(DNase、RNase free) 100ml
R0022 DEPC水(DNase、RNase free) 500ml
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D0033 PCR纯化试剂盒/DNA纯化试剂盒 50次
D0041S BeyoMag™磁珠法PCR/DNA纯化试剂盒 50次
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D7035 Klenow Fragment 100U
D7073 DNase I 200U
D7076 DNase I 1000U
D7378-250µl ATP (100mM, Nuclease free) 250µl
D7378-1ml ATP (100mM, Nuclease free) 1ml
D7378-5ml ATP (100mM, Nuclease free) 5ml
D7379-250μl CTP (100mM, Nuclease free) 250µl
D7379-1ml CTP (100mM, Nuclease free) 1ml
D7379-5ml CTP (100mM, Nuclease free) 5ml
D7380-250μl GTP (100mM, Nuclease free) 250μl
D7380-1ml GTP (100mM, Nuclease free) 1ml
D7380-5ml GTP (100mM, Nuclease free) 5ml
D7381-250μl UTP (100mM, Nuclease free) 250μl
D7381-1ml UTP (100mM, Nuclease free) 1ml
D7381-5ml UTP (100mM, Nuclease free) 5ml
D7383-1ml NTP set (100mM each, Nuclease free) 4×250µl
D7385-500μl NTP Mix (10mM each, Nuclease free) 500μl
D7385-2ml NTP Mix (10mM each, Nuclease free) 2ml
D7387-250μl NTP Mix (25mM each, Nuclease free) 250μl
D7387-1ml NTP Mix (25mM each, Nuclease free) 1ml
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