使用说明：
1.准备工作。
a.将要标记的生物大分子溶解在1X PBS (C0221A)中，使终浓度约为0.5-3mg/ml。如果溶液里有额外的伯胺(如Tris或Glycine)或者铵离子，推荐使用碧云天脱盐柱(P2603/P2605/P2607/P2613/P2615/P2617)进行脱盐处理。
b.5mg/ml Reactive FITC的配制：称量适量的Reactive FITC，用试剂盒中的提供的无水溶剂进行溶解配制成5mg/ml Reactive FITC。如果短期内全部使用完毕，可以使用试剂盒中提供的全部的无水溶剂溶解全部的Reactive FITC，充分溶解后即为5mg/ml Reactive FITC，例如小包装中的2mg Reactive FITC用400μl无水溶剂进行溶解。如不立即使用，可分装后-20ºC避光保存，两个月内有效。
c.1M NaHCO3的配制：根据样品量配制适量的1M NaHCO3溶液，如称取10mg NaHCO3，加入119µl超纯水即得1M NaHCO3溶液。NaHCO3可维持标记反应体系的pH在7-9之间，提高标记效率，一般加入量为样品体积的1/10。注：NaHCO3溶液需现用现配。
2.小量样品(不超过130µl, 蛋白浓度不超过3mg/ml)的FITC标记反应。
以下以样品体积为0.1ml为例，其它样品体积可按比例调整。
a.将需要标记的0.1ml生物大分子转移到洁净的1.5ml离心管(FTUB306)，加入10µl新鲜配制的1M NaHCO3溶液。
b.根据样品浓度，参照下表计算加入5mg/ml Reactive FITC的体积。

Concentration of Biomolecule Solution	Volume of Biomolecule Solution	Volume of Reactive FITC Solution
0.5mg/ml	0.1ml	1µl
1.0mg/ml	0.1ml	2µl
1.5mg/ml	0.1ml	3µl
2.0mg/ml	0.1ml	4µl
2.5mg/ml	0.1ml	5µl
3.0mg/ml	0.1ml	6µl

c.在室温(约25ºC)反应30-60分钟或者4ºC反应2小时，反应过程推荐在翘板摇床(也称侧摆摇床)上进行。推荐使用BeyoShaker™数字式翘板摇床(E6673)。也可以使用LCD数控型长轴旋转混匀仪(E1505)，推荐的速度为25rpm上下翻转。
d.脱盐柱的准备：移去脱盐柱Desalting Column (5kDa MWCO, 0.5ml)的下堵头，置于1.5ml离心管或2ml洗脱管中，1,000×g离心1分钟，丢弃脱盐柱离心下来的保存溶液，并重新把脱盐柱放回离心管中。使用非水平转头的情况下，由于离心会使树脂压实形成一个向上的斜面，该斜面的方向宜在后续步骤中保持，所以在脱盐柱外壳上的斜面向上位置做标记，在随后的离心步骤中需要调整好离心管的放入方向，确保离心后斜面的方向和位置不会改变。
e.脱盐柱的预平衡：向脱盐柱树脂顶部加入0.5ml 1X PBS以平衡脱盐柱，1,000×g离心1分钟，丢弃溶液，重复本步骤2-3次。
f.上样：将脱盐柱放入新的1.5ml离心管中，把步骤3c的样品(不能超过130µl)加入到树脂的中心位置，使树脂吸入样品。
注：样品体积不要超过脱盐柱规定的样品量体积，否则会降低样品回收率。
g.洗脱：将脱盐柱1,000×g离心2分钟，流穿液含有纯化的FITC标记的生物大分子，可以直接用于后续实验。如需保存，请保存在合适的条件。注：脱盐柱不适合重复使用。
h.如需计算FITC标记蛋白的标记效率，请参考步骤5。
3.中量样品(不超过0.5ml, 蛋白浓度不超过3mg/ml)的FITC标记反应。
以下以样品体积为0.5ml为例，其它样品体积可按比例调整。
a.将需要标记的0.5ml生物大分子转移到洁净的1.5ml离心管(FTUB306)，加入50µl新鲜配制的1M NaHCO3溶液。
b.根据样品浓度，参照下表计算加入5mg/ml Reactive FITC的体积。

Concentration of Biomolecule Solution	Volume of Biomolecule Solution	Volume of Reactive FITC Solution
0.5mg/ml	0.5ml	5µl
1.0mg/ml	0.5ml	6µl
1.5mg/ml	0.5ml	8µl
2.0mg/ml	0.5ml	11µl
2.5mg/ml	0.5ml	13µl
3.0mg/ml	0.5ml	15µl

c.在室温(约25ºC)反应30-60分钟或者4ºC反应2小时，反应过程推荐在翘板摇床(也称侧摆摇床)上进行。推荐使用BeyoShaker™数字式翘板摇床(E6673)。也可以使用LCD数控型长轴旋转混匀仪(E1505)，推荐的速度为25rpm上下翻转。
d.脱盐柱的准备：移去脱盐柱Desalting Column (5kDa MWCO, 2ml)的下堵头，置于15ml离心管中，1,000×g离心2分钟，丢弃脱盐柱离心下来的保存溶液，并重新把脱盐柱放回离心管中。使用非水平转头的情况下，由于离心会使树脂压实形成一个向上的斜面，该斜面的方向宜在后续步骤中保持，所以在脱盐柱外壳上的斜面向上位置做标记，在随后的离心步骤中需要调整好离心管的放入方向，确保离心后斜面的方向和位置不会改变。
e.脱盐柱的预平衡：向脱盐柱的树脂顶部加入1.5ml 1X PBS以平衡脱盐柱，1,000×g离心2分钟，丢弃溶液，重复本步骤2-3次。
f.上样：将脱盐柱放入新的15ml离心管中，把步骤3c的样品(不能超过0.5ml)加入到树脂的中心位置，使树脂吸入样品。
注：如果样品体积<400µl，在树脂吸入样品后再加入100µl超纯水可以增加样品回收率，但同时会稀释标记样品的浓度。
g.洗脱：将脱盐柱 1,000×g离心2分钟，流穿液含有纯化的FITC标记的生物大分子，可以直接用于后续的实验。如需保存，请保存在合适的条件。注：脱盐柱不适合重复使用。
h.如需计算FITC标记蛋白的标记效率，请参考步骤5。
4.大量样品(不超过2.5ml, 蛋白浓度不超过3mg/ml)的FITC标记反应。
以下以样品体积为2ml为例，其它样品体积可按比例调整。
a.将需要标记的2ml生物大分子转移到洁净的15ml离心管(FTUB515)，加入200µl新鲜配制的1M NaHCO3溶液。
b.根据样品浓度，参照下表计算加入5mg/ml Reactive FITC的体积。

Concentration of Biomolecule Solution	Volume of Biomolecule Solution	Volume of Reactive FITC Solution
0.5mg/ml	2ml	20µl
1.0mg/ml	2ml	24µl
1.5mg/ml	2ml	32µl
2.0mg/ml	2ml	44µl
2.5mg/ml	2ml	52µl
3.0mg/ml	2ml	60µl

c.在室温(约25ºC)反应30-60分钟或者4ºC反应2小时，反应过程推荐在翘板摇床(也称侧摆摇床)上进行。推荐使用BeyoShaker™数字式翘板摇床(E6673)。也可以使用LCD数控型长轴旋转混匀仪(E1505)，推荐的速度为25rpm上下翻转。
d.脱盐柱的准备：移去脱盐柱Desalting Column (5kDa MWCO, 8ml)的下堵头，置于50ml离心管中，1,000×g离心2分钟，丢弃脱盐柱离心下来的保存溶液，并重新把脱盐柱放回离心管中。使用非水平转头的情况下，由于离心会使树脂压实形成一个向上的斜面，该斜面的方向宜在后续步骤中保持，所以在脱盐柱外壳上的斜面向上位置做标记，在随后的离心步骤中需要调整好离心管的放入方向，确保离心后斜面的方向和位置不会改变。注：Desalting Column (5kDa MWCO, 8ml)放入50ml离心管内进行离心时，需要使用相应的适配器(Adaptor)，如12ml层析柱转50ml离心管适配器(FSA013)。
e.脱盐柱的预平衡：向脱盐柱的树脂顶部加入5ml 1X PBS以平衡脱盐柱，1,000×g离心2分钟，丢弃溶液，重复本步骤2-3次。
f.上样：将脱盐柱放入新的50ml离心管中，把步骤4c的样品(不能超过2.5ml)加入到树脂的中心位置，使树脂吸入样品。
注：如果样品体积<1.8ml，在树脂吸入样品后再加入200µl超纯水可以增加样品回收率，但同时会稀释标记样品的浓度。
g.洗脱：将脱盐柱 1,000×g离心2分钟，流穿液含有纯化的FITC标记的生物大分子，可以直接用于后续的实验。如需保存，请保存在合适的条件。注：脱盐柱不适合重复使用。
h.如需计算FITC标记蛋白的标记效率，请参考步骤5。
5.FITC标记效率的计算。
a.将标记好的样品用1M NaHCO3溶液进行稀释，稀释倍数记为Dilution factor。
b.蛋白浓度的计算：
蛋白浓度(M)可直接使用标记时的蛋白浓度(mg/ml)进行计算，一般脱盐柱纯化不会损失蛋白，只是去除未标记的FITC和盐离子。但在蛋白浓度比较低时，蛋白回收率可能在90%左右，计算蛋白浓度时需要在初始蛋白浓度的基础上，乘以回收系数0.9。
Protein concentration (M) = (Protein concentration (mg/ml))/(MW of protein)
注：对于大多数IgG, MW of protein = 145,000。
c.FITC标记数的计算：
FITC per protein molecule = (A495×Dilution factor)/(68,000×Protein concentration (M))
其中：68,000cm-1M-1是FITC在pH8.0时在495nm处的摩尔消光系数(ε)；FITC的最大吸收光波长是495nm，可使用1cm比色皿或酶标仪测定A495，如果使用酶标仪测定，消光系数需乘以L (cm)。L (cm)为测吸光度时的路径长度(Pathlength)，如100μl样品在一般的96孔中的L (cm)约为0.276，而超微量分光光度计的L (cm)约为0.02-0.1。如果使用不同的反应孔或超微量分光光度计，请注意修改L (cm)的值。
d.计算举例：如果已知蛋白是Casein，分子量约为24kDa，蛋白初始浓度是2mg/ml，计算可得Protein concentration (M)为0.0000833；稀释10倍后，使用Varioskan LUX多功能酶标仪测得A495的吸收值为0.1316，此时Dilution factor为10，L (cm)为0.049，计算FITC标记数 = 0.1316×10/(68000×0.049×0.000083) = 4.74。
6.FITC标记物的保存。
a.如果使用提供的脱盐柱纯化，FITC标记物可保存在PBS中，加入ProClean 300 (ST853)使终浓度为0.1%，4ºC避光保存。
b.如果纯化后的标记物浓度低于1mg/ml，加入1-10mg/ml的BSA (ST023)或者其它稳定蛋白以防止标记物的降解。
c.加入ProClean 300后，FITC标记抗体通常可以在4ºC稳定保存不少于1个月。如果长期保存，建议分装后-20ºC避光保存，避免反复冻融。
参考文献：
1.Chaganti LK, Venkatakrishnan N, Bose K. Biosci Rep. 2018. 38(6): BSR20181764.
2.Stabenfeldt SE, LaPlaca MC. Acta Biomater. 2011. 7(12):4102-8.
3.Bian ZM, Field MG, Elner SG, Kahlenberg JM, Elner VM. Exp Eye Res. 2018. 170:29-39.
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产品编号	产品名称	包装
C0221A	PBS	500ml
E6673	BeyoShaker™数字式翘板摇床	1套
E1505	LCD数控型长轴旋转混匀仪	1台
P0632S	生物素快速标记试剂盒(Biotin-LC-NHS)	0.3mg×10次
P0632M	生物素快速标记试剂盒(Biotin-LC-NHS)	1.3mg×10次
P0632L	生物素快速标记试剂盒(Biotin-LC-NHS)	6.6mg×10次
P0639S	FITC快速标记试剂盒	0.3mg×10次
P0639M	FITC快速标记试剂盒	1.3mg×10次
P0639L	FITC快速标记试剂盒	6.6mg×10次
P2603	BeyoDesalt™ G-10 Spin脱盐柱	20/100个
P2605	BeyoDesalt™ G-10 Mini脱盐柱	5/20个
P2607	BeyoDesalt™ G-10 Midi脱盐柱	5/20个
P2609	BeyoDesalt™ G-10 Max脱盐柱	5/20个
P2613	BeyoDesalt™ G-25 Spin脱盐柱	20/100套
P2615	BeyoDesalt™ G-25 Mini脱盐柱	5/20个
P2617	BeyoDesalt™ G-25 Midi脱盐柱	5/20个
P2619	BeyoDesalt™ G-25 Max脱盐柱	5/20个
P2621	BeyoDesalt™ G-25脱盐柱(Superfine, 5ml)	1/5个
P2623	BeyoDesalt™ G-25脱盐柱(Fine, 70ml)	1/5个
P2627	BeyoDesalt™ 6FF Spin脱盐柱	20/100套
P2629	BeyoDesalt™ 6FF Mini脱盐柱	5/20个
P2631	BeyoDesalt™ 6FF Midi脱盐柱	5/20个
P2633	BeyoDesalt™ 6FF Max脱盐柱	5/20个
P2635	BeyoDesalt™ 6FF脱盐柱(Superfine, 5ml)	1/5个
P2637	BeyoDesalt™ 6FF脱盐柱(Fine, 70ml)	1/5个
ST476	PBS (10X)	500ml