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核酸相关> DNA操作> 修饰酶
E.coli DNA Polymerase I
产品编号: D7043S
产品包装:250U
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价格: ¥ 119.00
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产品编号 产品名称 产品包装 产品价格
D7043S E.coli DNA Polymerase I 250U 119.00元
D7043M E.coli DNA Polymerase I 1000U 389.00元
D7043L E.coli DNA Polymerase I 5000U 1598.00元

碧云天生产的E.coli DNA Polymerase I,即大肠杆菌DNA聚合酶I,是由碧云天自主研发的PerfectProtein™技术平台表达、纯化获得的一种DNA模板依赖的DNA聚合酶,可以在单链DNA模板和与其配对的引物存在的条件下,催化5'→3'方向的DNA合成[1]。E.coli DNA Polymerase I同时还具备双链DNA缺刻(nick)处特异性的5'→3'外切酶活性、单链特异性的3'→5'外切酶活性以及核糖核酸酶H活性[2]。E.coli DNA Polymerase I的DNA合成酶活性和双链DNA缺刻(nick)处特异性的5'→3'外切酶活性,可以实现缺刻处3'-OH起始的DNA合成和5'端单链DNA的降解,实现缺口平移。E.coli DNA Polymerase I的单链特异性的3'→5'外切酶活性可以起到DNA合成的校验作用(proofreading)。在有dNTP存在的情况下,E.coli DNA Polymerase I更多地表现为DNA聚合酶活性;而当dNTP不存在的情况下,E.coli DNA Polymerase I更多表现为单链特异性的外切酶活性,例如可以表现为平末端双链DNA中的任一条链的5'端的5'→3'外切酶活性。

E.coli DNA Polymerase I的多功能性可实现以双链DNA中的缺刻或缺口为起点合成新的DNA链;从缺口处降解与模板链互补的DNA链,实现DNA的缺口平移;保证DNA复制过程中错配的校对,并对复制和修复中出现的空隙进行填补[3]。

碧云天生产的E.coli DNA Polymerase I补平双链DNA 5'突出末端(5' overhang)的效果参考图1。

图1. 碧云天生产的E.coli DNA Polymerase I (D7043)补平双链DNA 5'突出末端(5' overhang)的效果图。在20µl反应体系中加入图中指定量的本产品或N公司(Competitor)的E.coli DNA Polymerase I,37ºC孵育20分钟进行反应,反应完成后75ºC孵育20分钟以终止反应。取出5μl反应产物,加入1μl 6X DNA Loading Buffer (D0071),然后进行15%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。180V电泳60分钟,之后用Gel-Red (EB升级换代产品,10000X) (D0139)室温染色5分钟,在紫外灯下观察实验结果。如图所示,本产品与N公司的产品相比,具有类似的催化效果。反应体系(20µl): 10mM Tris-HCl, 50mM NaCl, 10mM MgCl2, 1mM DTT, 100µM dNTP Mix, 0.5µM dsDNA with 5' overhang (pH7.9 @ 25ºC)。dsDNA with 5' overhang (也称具有5'突出末端的双链线性DNA)是使用Annealing Buffer for DNA Oligos (5X) (D0251)并按照该产品说明书推荐的程序,把5'-ATACATAGATACATAGACTGGCCGTCGTTTTAC-3'和5'-GTAAAACGACGGCCAGT-3'这两条寡核苷酸链进行退火反应得到的产物,并以此退火产物为底物,进行双链DNA 5'突出末端的补平。实际操作时不同实验条件获得的实验结果会略有差异,图中所示结果仅供参考。

碧云天生产的E.coli DNA Polymerase I对3'端带有氨基修饰的双链线性DNA消化(5'→3'外切酶活性)的效果参考图2。

图2. 碧云天生产的E.coli DNA Polymerase I (D7043)对3'端带有氨基修饰的双链线性DNA消化(5'→3'外切酶活性)的效果图。在20µl反应体系中加入图中指定量的本产品或N公司(Competitor)的E.coli DNA Polymerase I,37ºC孵育20分钟进行反应,反应完成后75ºC孵育20分钟以终止反应。取出5μl反应产物,加入1μl 6X DNA Loading Buffer (D0071),然后进行15%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。180V电泳60分钟,之后用Gel-Red (EB升级换代产品,10000X) (D0139)室温染色5分钟,在紫外灯下观察实验结果。如图所示,本产品与N公司的产品相比,具有类似的催化效果。反应体系(20μl):10mM Tris-HCl, 50mM NaCl, 10mM MgCl2, 1mM DTT, 0.5µM dsDNA。3'端带有氨基修饰的单链DNA不会被E.coli DNA Polymerase I 的3'→5'外切酶活性所降解。3'端带有氨基修饰的dsDNA是使用Annealing Buffer for DNA Oligos (5X) (D0251)并按照该产品说明书推荐的程序,把5'-ATACATAGATACATAGACTGGCCGTCGTTTTAC-3'NH2和5'-GTAAAACGACGGCCAGTCTATGTATCTATGTAT-3'NH2这两条寡核苷酸链进行退火反应得到的产物,并以此退火产物为底物,进行双链线性DNA消化。实际操作时不同实验条件获得的实验结果会略有差异,图中所示结果仅供参考。

用途:DNA合成;双链DNA 5'突出末端(5' overhang)的补平;双链DNA 3'突出末端(3' overhang)的削平;cDNA第二条链合成[4];与DNase I一起使用,进行DNA切口平移;DNA的切口翻译以获得具有高比活性的探针。

来源:纯化自携带编码E.coli DNA Polymerase I基因的E.coli重组菌株。

活性定义:One unit is defined as the amount of enzyme that will incorporate 10nmol of dNTP into acid insoluble material in 30 minutes at 37°C.

纯度:不含除E.coli DNA Polymerase I之外的其它种类的DNA外切酶,不含内切酶,不含RNase。

酶储存液:25mM Tris-HCl, 1mM DTT, 0.1mM EDTA, 50% Glycerol (pH7.4 @25ºC)。

10X Reaction Buffer: 100mM Tris-HCl, 500mM NaCl, 100mM MgCl2, 10mM DTT (pH7.9 @25ºC)。

失活或抑制:75ºC孵育20分钟可使E.coli DNA Polymerase I失活。

包装清单:
产品编号 产品名称 包装
D7043S-1 E.coli DNA Polymerase I (10U/μl) 25μl
D7043S-2 10X Reaction Buffer 100μl
说明书 1份

产品编号 产品名称 包装
D7043M-1 E.coli DNA Polymerase I (10U/μl) 100μl
D7043M-2 10X Reaction Buffer 400μl
说明书 1份

产品编号 产品名称 包装
D7043L-1 E.coli DNA Polymerase I (10U/μl) 500μl
D7043L-2 10X Reaction Buffer 2ml
说明书 1份
保存条件:

-20ºC保存,两年有效。

注意事项:

由于E.coli DNA Polymerase I具有外切酶活性,在进行反应前应尽量避免环境温度偏高导致的DNA链被切除。

E.coli DNA Polymerase I不具有内切酶活性,且本产品不包含DNase I,进行切口翻译反应时必须另外添加DNase I。

E.coli DNA Polymerase I剧烈震荡或搅拌会使酶失活。

E.coli DNA Polymerase I与DNA的亲和力较高,加入过量的酶易发生凝集作用(Aggregation),影响反应的进行。

E.coli DNA Polymerase I可使用带修饰的核苷酸(例如生物素、地高辛、荧光标记核苷酸)作为DNA合成的底物,以用于DNA探针的标记。

酶使用时宜存放在冰盒内或冰浴上,使用完毕后宜立即放置于-20℃保存。

本产品仅限于专业人员的科学研究用,不得用于临床诊断或治疗,不得用于食品或药品,不得存放于普通住宅内。

为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用说明:
1. 双链DNA 5'突出末端(5' overhang)的补平:
a. 对于双链DNA 5'突出末端(5' overhang)的补平,参考下表在冰浴中配制反应体系(以20μl体系为例)。
Reagent Volume Final Concentration
Nuclease-Free Water (16-x)μl -
dsDNA with 5' overhang xμl ~0.5µM or 5-200ng/µl
10X Reaction Buffer 2μl 1X
dNTP Mix (2mM each) 1μl 100μM
E.coli DNA Polymerase I (10U/µl) 1μl 0.5U/µl
Total Volume 20μl -
注1:在进行末端补平实验时可适当减少酶量,避免在外切酶活性的作用下导致模板的缺失。
注2:如果同时进行多个反应,可以把上表中除dsDNA with 5' overhang之外的所有溶液和酶提前混合,分装到各反应管,最后再加入dsDNA with 5' overhang。
注3:dsDNA with 5' overhang如果是寡核苷酸,最终浓度可以约为0.5µM;如果是消化后的DNA质粒等最终浓度可以约为5-200ng/μl。
b. 按上表设置好反应体系后,适当轻轻混匀反应体系,随后低速离心以使粘附在管壁上的液体沉淀至管底。
c. 反应条件:37ºC孵育20分钟。注:反应时间可以根据实际情况酌情适当调节。
d. 终止反应:75ºC孵育20分钟使E.coli DNA Polymerase I失去活性。
2. 双链线性DNA的消化:
a. 对于双链线性DNA消化,参考下表在冰浴中配制如下反应体系(以20μl体系为例)。
Reagent Volume Final Concentration
Nuclease-Free Water (17-x)μl -
dsDNA xμl ~0.5µM or 5-200ng/µl
10X Reaction Buffer 2μl 1X
E.coli DNA Polymerase I (10U/µl) 1μl 0.5U/µl
Total Volume 20μl -
注:如果同时进行多个反应,可以把上表中除dsDNA之外的所有溶液和酶提前混合,分装到各反应管,最后再加入dsDNA。
b. 按上表设置好反应体系后,适当轻轻混匀反应体系,随后低速离心以使粘附在管壁上的液体沉淀至管底。
c. 反应条件:37ºC孵育20分钟。注:反应时间可以根据实际情况酌情适当调节。
d. 终止反应:75ºC孵育20分钟使E.coli DNA Polymerase I失去活性。
3. 其它用途可以参考适当的文献资料进行。
常见问题:
1. E.coli DNA Polymerase I能补平3'突出末端吗?
不能,E.coli DNA Polymerase I只能通过移除3'突出末端的方式形成平末端。E.coli DNA Polymerase I (D7043)、Klenow Fragment (D7037)、T4 DNA Polymerase(D7052)是削平3'突出末端的最佳选择。
2. E.coli DNA Polymerase I能补平DNA的5'突出末端吗?
可以,5'突出末端会被补平,3'突出末端会被削平。Klenow Fragment (D7037)缺乏5'→3'外切酶活性,是补平DNA的5'突出末端的首选酶。
3. E.coli DNA Polymerase I能用于切口平移实验吗?
能,切口平移实验是该酶的重要应用之一。
4. 切口平移实验时有温度要求吗?
切口平移时的孵育温度应低于20ºC。在较高的温度下,新合成的链可以分离并被复制。
5. E.coli DNA Polymerase I可以热失活吗?
可以。反应结束后添加10mM EDTA螯合Mg2+,当温度升高时,可以保护DNA末端,然后在75ºC加热20分钟即可将酶灭活。
6. E.coli DNA Polymerase I能移除5'突出末端吗?
不能,E.coli DNA Polymerase I的5'→3'外切酶活性仅适用于双链DNA缺刻处。
7. DNA切口平移能够用来做标记探针吗?
可以,DNA聚合酶I用5'→3'核酸外切酶去除缺口处的前导碱基,并用标记的碱基填充。该方法适于制作大而均匀的探针,但比活性不高。
参考文献:
1. Kunkel TA, Loeb LA, Goodman MF. J Biol Chem. 1984. 259(3):1539-45.
2. Green MR, Sambrook J. Cold Spring Harb Protoc. 2020. 2020(5):100743.
3. Yu H, Chao J, Patek D, Mujumdar R, Mujumdar S, Waggoner AS. Nucleic Acids Res. 1994. 22(15):3226-32.
4. D'Alessio JM, Gerard GF.Nucleic Acids Res. 1988. 16(5):1999-2014.
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D7037S Klenow Fragment 200U
D7037M Klenow Fragment 1000U
D7037L Klenow Fragment 5000U
D7053S phi29 DNA Polymerase 250U
D7053M phi29 DNA Polymerase 1kU
D7053L phi29 DNA Polymerase 5kU
D7053XL phi29 DNA Polymerase 20kU
D7039 Klenow Fragment, Exo- 100U
D7041S Klenow Fragment, Exo- 200U
D7041M Klenow Fragment, Exo- 1000U
D7041L Klenow Fragment, Exo- 5000U
D7043S E.coli DNA Polymerase I 250U
D7043M E.coli DNA Polymerase I 1000U
D7043L E.coli DNA Polymerase I 5000U
D7051 T4 DNA Polymerase 50U
D7052S T4 DNA Polymerase 150U
D7052M T4 DNA Polymerase 750U
D7052L T4 DNA Polymerase 3kU
D7096 T4 Polynucleotide Kinase 100U
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D7176M BeyoRT™ III M-MLV反转录酶 50KU
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D7213S BeyoAmp™ Extra-long DNA Polymerase 200U
D7213M BeyoAmp™ Extra-long DNA Polymerase 1000U
D7215S BeyoAmp™ Plus Extra-long DNA Polymerase 200U
D7215M BeyoAmp™ Plus Extra-long DNA Polymerase 1000U
D7220 BeyoFusion™ DNA Polymerase 200U
D7221 BeyoFusion™ DNA Polymerase 1000U
D7371 dNTP Mixture (2.5mM each) 1ml
D7373 dNTP Mixture (25mM each) 250μl
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