新品上架：CRISPR/Cas9等基因突变鉴定必备！

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2018年11月，“基因编辑婴儿”事件震惊中外。“基因编辑技术”似乎一夜之间以一种最糟糕的方式被大众所认知，给国内科研界带来了一发深水炸弹，也让CRISPR/Cas9等基因编辑技术走进了更多人的视线。

基因编辑到底是什么呢?

基因编辑（gene editing）是一种新兴的比较精确的能对生物体基因组特定目标基因进行修饰的一种基因工程技术或过程。基因编辑依赖于经过基因工程改造的核酸酶，也称“分子剪刀”，在基因组中特定位置产生位点特异性双链断裂（DSB），诱导生物体通过非同源末端连接（NHEJ）或同源重组（HR）来修复DSB，因为这个修复过程容易出错，从而导致靶向突变,这种靶向突变就是基因编辑。基因编辑以其能够高效率地进行定点基因组编辑，在基因研究、基因治疗和遗传改良等方面展示出了巨大的潜力。ZFN,TALEN和CRISPR-Cas9系统是三大基因编辑工具，其中CRISPR-Cas9目前应用更为广泛。其共同特点是利用DNA结合域识别靶点DNA序列，核酸内切酶或者Cas蛋白将DNA剪切，靶向DNA断裂再启动DNA损伤修复机制，实现基因敲除、插入等。为了确认基因编辑实现与否，碧云天重磅推出CRISPR/Cas9等基因突变鉴定必备新品——T7 Endonuclease I ！

碧云天生产的T7 Endonuclease I (T7 Endo I,T7EI)，即T7核酸内切酶I，是一种比较特殊的DNA内切酶，能识别并切割不完全配对的DNA(non-perfectly matched DNA)、十字型结构DNA(cruciform DNA structures)、Holliday结构或交叉DNA(Holliday structures or junctions)和异源双链DNA(heteroduplex DNA)。T7EI切割的位点位于错配碱基5’端的第一、第二或第三个磷酸二脂键。此外，T7EI也能以很慢的速度切割含有缺刻的双链DNA(nicked double-stranded DNA)，常用于CRISPR/Cas9等导致的基因突变的鉴定。

图1：T7 Endonuclease I (T7EI)切割位点示意图。X，代表错配位点。需要特别注意的是T7EI能识别长度大于或等于2bp的插入、缺失或突变导致的错配DNA，不能识1bp的插入、缺失或突变。

检测原理：
提取经过基因编辑的细胞、组织或器官的基因组DNA后，通过高保真PCR扩增酶从被编辑的基因组DNA中扩增出被编辑过的DNA片段。扩增的目的片段进行变性和退火处理，然后用T7EI进行酶切鉴定。如果部分细胞中成功出现了基因编辑导致的插入或缺失突变，PCR扩增产物变性和退火后，未突变的和突变的基因之间，不同突变的基因之间，都会形成不完全配对的双链DNA。而T7EI酶能识别并酶切不完全配对的双链DNA。这样对于T7EI酶切产物进行电泳分析，就能知道基因组是否被成功编辑，以及被编辑的效率。

产品用途：
1.CRISPR/Cas9、TALEN或以及其它基因编辑工具形成的突变体检测；
2.基因点突变和SNP的检测；
3.分解四方向交叉DNA(four-way junction)或分支DNA(branched DNA)；
4.检测或切割异源双链DNA和缺刻DNA(heteroduplex and nicked DNA)；
5.随机切割线性DNA(借助线性DNA分子内或分子间部分配对形成的不完全匹配双链DNA)用于进行鸟枪法(Shot-gun)克隆和测序等。

产品特点：
酶活性高：品质可媲美国际知名品牌同类产品；
兼容性好：与碧云天的多种PCR扩增体系可完全兼容(图3)。对于PCR产物通常无须任何纯化处理即可用于本产品的酶切鉴定；
纯度高：纯度大于95%，不含T7EI之外的DNA内切酶和外切酶，不含RNA酶，不含磷酸酯酶。
产品效果：

图2.碧云天生产的T7EI和国际知名品牌的同类产品(Competitor T7EI)酶切野生型/突变体形成的杂合双链DNA效果图。使用高保真酶分别PCR扩增不带突变位点的野生型DNA片段(WT，800bp)以及有5个碱基突变的DNA片段(Mutant，800bp)，经电泳检测它们的PCR产物均为单一条带后，按图所示将200ng的野生型片段、200ng的突变体片段及100 ng突变体片段与100 ng野生型混合物分别经变性、退火和复性处理(95℃ 5min, 95℃-85℃ -2℃/second, 85°C-25°C -0.1°C/second)后加入10U T7EI，37℃酶切30min，然后进行1%的琼脂糖凝胶电泳检测。如图所示，野生型与突变体的混合物经退火后部分片段会形成5个碱基的错配loop区并被T7EI识别和酶切，800bp的片段被切割成600bp和200bp两个片段，而单独的野生型或单独的突变体则不会被切割。

图3.碧云天生产的T7 Endonuclease I (T7EI)对于碧云天不同PCR buffer的兼容效果。酶切体系为20µl ，将本试剂盒提供的Control Template (D7080-3)分别加入不同的PCR buffer体系至PCR buffer为1X，混匀后，取5µl至一新的离心管中作为酶切底物。随后加入2µl 10X Reaction Buffer (D7080-2)、12µl 超纯水和1µl T7EI (10U/µl) (D7080-1)，混匀后37°C酶切30min，1%的琼脂糖凝胶电泳检测。1. 不加T7EI；2. 加T7EI，用水取代PCR buffer；3. D7205-2 10X PCR Buffer (with Mg2+)；4. D7218-2 10X BeyoTaq Buffer (with Mg2+)；5. D7216-2 10X Pfu Buffer (with Mg2+)；6. D7220-2/D7222-2 10X BeyoFusion™ Buffer (with Mg2+)；7. D7211-2 10X Hot-Start PCR Buffer；8. D7213-2 10X BeyoAmp™ Buffer；9. D7215-2 10X BeyoAmp™ Plus Buffer；10. D7241S-2 10X HemoTaq™ PCR Buffer；11. D7243S-2 10X HemoTaq™ HF PCR Buffer；12. D7248S-2 10X PlantTaq™ PCR Buffer。如图所示，本产品和这些PCR buffer体系都可以很好兼容。因此在目的条带正确且单一时可以不经过纯化直接取5µl PCR产物至酶切体系中变性退火后进行酶切反应。

订购信息：
产品编号 产品名称 包装 产品价格
D7080S T7 Endonuclease I (CRISPR等基因突变鉴定用) 250U
D7080M T7 Endonuclease I (CRISPR等基因突变鉴定用) 1250U
D7080L T7 Endonuclease I (CRISPR等基因突变鉴定用) 5000U

利用T7 Endonuclease I (T7EI)能识别并酶切不完全配对的DNA双链的特性，碧云天还特别研发了用于检测基因组DNA在基因编辑后发生突变的试剂盒——基因组编辑突变检测试剂盒(D0508)。

产品特点：
组分齐全：该试剂盒提供了包括一步法基因组DNA提取、高保真PCR扩增、变性退火和T7EI酶切的全套试剂，并且还提供了阳性对照；
使用便捷：一步法基因组DNA提取非常快速便捷，提取后可以直接用于高保真PCR扩增，PCR扩增产物可直接用于后续的变性退火和T7EI酶切，无需额外的分离纯化步骤；
有效减少假阳性：试剂盒提供包含了高保真酶BeyoFusion™ DNA Polymerase的BeyoFusion™ Master Mix (2X)，确保扩增产物能被高保真扩增，不会产生基因组编辑突变检测的假阳性。

产品效果：

图4.该试剂盒检测HEK293T细胞基因组编辑突变的效果图。将HEK293T细胞种于六孔板中，待细胞融合度约80%的时候，用碧云天Lipo8000™转染试剂(C0533)将表达Cas9蛋白和靶向人Hace-1基因的guide RNA的质粒转染HEK293T细胞，同时转染空载质粒(empty vector)作为阴性对照。转染24h后消化细胞接种于96孔板中，每孔约3万个细胞，24h后，弃上清向孔内加入添加了Enzyme Mix的DNA Extraction Solution提取基因组(68°C, 15min; 95°C, 10min)。用BeyoFusionTM Master Mix (2X)扩增靶基因，扩增产物经变性和退火处理后(95°C 5min; 95°C-85°C, 2°C/s; 85°C-25°C, 0.1°C/s)，加入1μl T7EI，37°C酶切15min，2%琼脂糖凝胶电泳检测。转染含有靶向Hace-1基因的guide RNA的质粒时会形成插入或缺失突变，进行基因扩增后，未突变的和突变的基因片段配对会形成不完全匹配的双链DNA，被T7EI识别和酶切后，约520bp的退火片段中的不完全匹配的双链DNA会被酶切成约290bp和230bp的两个片段。转染空载质粒对靶基因没有影响，不会产生T7EI酶切产生的小片段。

订购信息：
产品编号 产品名称 包装 产品价格
D0508S 基因组编辑突变检测试剂盒 25次
D0508M 基因组编辑突变检测试剂盒 100次